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五输穴首见于《灵枢·九针十二原》篇，云：“五脏五俞（引文中俞通腧、输，下同），五五二十五俞，六腑六俞，六六三十六俞。经脉十二，络脉十五，凡二十七气以上下。所出为井，所溜为荥，所注为俞，所行为经，所入为合，二十七气所行，皆在五俞也。”古人用自然界的水流由小到大、由浅入深的变化，来比喻经气在经脉中运行的特点。即“井”为初出之意，像水的源头，比喻脉气运行起始的部位；“荥”为小水流之意，像水流刚形成小流而未成大流，比喻脉气逐渐充盈的部位；“输”为灌注、输送之意，像水流灌注由少向多变化，比喻脉气运行较盛的部位；“经”同径，为直行道路之意，像水在河道中畅行流过，比喻脉气运行通畅的部位；“合”为汇集之意，如江河水归入大海，比喻脉气运行汇集的部位。由此可见，五输穴是脏腑经脉气血运行出入的部位，也是调节脏腑经络、阴阳气血的重要穴位。
五输穴的临床运用，总体上的论述如《灵枢·邪气脏腑病形》云：“荥俞治外经，合治内府。”即荥穴、输穴多治疗经脉病证，而合穴多治疗与经脉配属的脏腑疾病。《难经·六十八难》又有所发挥，云：“井主心下满，荥主身热，俞主体重节痛，经主喘咳寒热，合主逆气而泄。此五脏六腑井荥俞经合所主病也。”这就是五输穴所主之病。如井穴能通接十二经之大气，能苏醒厥逆，兼有清热、通络止痛活血之功，所以临床上用于治疗急症或慢性病的急性发作。例如厥证，其病因虽各不相同，但病机则主要在于气机紊乱，升降乖异，气血妄行。其主要证候为：手足或四肢逆冷，或突然昏倒不省人事。井穴因能通接十二经气，使阴阳顺接，从而达到开窍苏醒之功。无论何种厥证，刺十二井穴出血均有较好疗效。中风及痫证等原因所致的厥证，应以针刺十二井穴为主，即可达到治疗或缓解的目的。荥穴有退热作用，既能退外感发热，又能清脏腑之热。对外感发热常“井”、“荥”合用，井穴放血，并根据兼证的不同配刺其他穴位。
另有关于《内经》中五输穴具体运用的记载现分述如下。
五变主五输
《灵枢·顺气一日分为四时》提出“五变主五俞”之说，如“人有五脏，五脏有五变，五变有五俞，故五五二十五俞，以应五时”。就本篇所提后人一般有两种认识：其一为按时序不同而分刺五输，即“脏主冬，冬刺井；色主春，春刺荥；时主夏，夏刺俞；音主长夏，长夏刺经；味主秋，秋刺合。是谓五变，以主五输”。其二为按病变表现的不同特征分刺五输，如“病在脏者，取之井；病变于色者，取之荥；病时间时甚者，取之俞；病变于音者，取之经；经满而血者，病在胃及以饮食不节得病者，取之合”。根据五变的具体情况，选择相应腧穴进行治疗，是针刺治疗的基本法则之一。临床上，一般根据病变不同，所刺腧穴各异的原则，以取穴施针。若能参合时日，则疗效更佳。
治咳证
《素问·咳论》在论及咳证的治法时说“治脏者治其俞，治腑者治其合，浮肿者治其经”。治疗脏咳，取五脏之输穴。五脏咳症状中多伴随疼痛，如《素问·咳论》云：“心咳之状，咳则心痛”、“肝咳之状，咳则两胁下痛”、“肾咳之状，咳则腰背相引而痛”等，即《难经》所云“俞主体重节痛”，故取俞穴。马玄台曰：“五脏俞穴者，肺俞太渊，脾俞太白，心俞神门，肾俞太溪，肝俞太冲是也。”治疗腑咳，取六腑的合穴。六腑咳症状中多伴随呕、遗矢、遗溺，如《素问·咳论》所云“胆咳之状，咳呕胆汁”、“大肠咳状，咳而遗矢”、“膀胱咳状，咳而遗溺”等，即《难经》所云“合主逆气而泄”，故取合穴。马玄台曰：“六腑合者，大肠合曲池，胃合三里，小肠合小海，膀胱合委中，三焦合天井，胆合阳陵泉是也。”治疗咳证兼浮肿者，加刺其经穴。咳嗽伴随浮肿者，即《难经》所云“经主喘咳寒热”，故取经穴。马玄台曰：“若脏腑之咳而面浮肿，则随脏腑之经穴而各分治之。肺之经穴经渠，大肠之经穴阳溪，胃之经穴解溪，脾之经穴商丘，心之经穴灵道，小肠之经穴阳谷，膀胱之经穴昆仑，肾之经穴复溜，心包络之经穴间使，三焦之经穴支沟，胆之经穴阳辅，肝之经穴中封是也。”
治痿证
《素问·痿论》对痿证的治疗原则除了“治痿独取阳明”之外，还有“补其荥、通其俞”。经云：“各补其荥而通其俞，调其虚实，和其逆顺，筋脉骨肉，各以其时受月，则病已矣。”吴崑注云：“十二经有荥有俞，所留为荥，所注为俞。补，致其气也；通，行其气也。”也是强调了治痿必须辨证论治，调其荥输，有虚有实，谨按时间。例如肺气热之痿躄，若肺有热邪，属实，则取肺经输穴太渊，泻法治之；若肺气不足，属虚，则取肺经荥穴鱼际，补法治之。故张介宾有云：“如筋痿者，取阳明、厥阴之荥俞；脉痿者，取阳明、少阴之荥俞；肉痿、骨痿其治皆然。”
治痹证
《素问·痹论》有云：“五脏有俞，六腑有合，循脉之分，各有所发，各随其过则病瘳也。”强调五脏痹以刺俞穴为主，六腑痹以刺合穴为主，五体痹要根据发病部位，进行循经取穴治疗，分辨其属于何经病变，进行针刺治疗。这也是痹症针刺原则之一，五脏痹以“通”为主，六腑痹以“泻”为要。如心痹取神门、心俞治之；肝痹去太冲、曲泉；肠痹取曲池、小海等。
综上所述，五输穴是腧穴中的一些特殊穴位，与脏腑关系密切，有重要的临床价值。另外值得说明的是，《灵枢·本输》所论手少阴心经所述各穴，都属于手厥阴心包经。因心与心包络本属一体，其气相通，心有病，则由心包络代心受邪。这也印证了关于《内经》经脉数目的不同学说中，“十一条经脉”理论确有其存在过的痕迹。