点击显示 收起
1.催化型受体（catalytic receptor）：具有酶活性的受体的一种。这类受体在其胞浆面有酪氨酸蛋白激酶的结构域，当配体与受体结合后，可激活酶的活性，从而使受体具有催化活性。生长因子、胰岛素及部分细胞因子受体属此类受体。
2.分子G蛋白：单体蛋白，分子量20-30kD，与一般G蛋白α亚基有高度同源性并具有相似性，同时与Ras蛋白具有较高同源性，又称为Ras超家族，分为Ras、Rho、Arf、Sar、Ran、Rab六个亚家族，参与多种信号传递途径。其中Ras蛋白是细胞增殖与分化的关键调节因子，其基因的突变与许多人类肿瘤有关。
3.大分子G蛋白（鸟苷酸结合蛋白（guanine nucleotide binding protein，简称G蛋白））：G蛋白是一类和GTP或GDP相结合、位于细胞膜胞浆面的外周蛋白，由三个亚基组成。他们是α亚基（45KD）、β亚基 （35KD）和γ亚基（7KD）。G蛋白有两种构象，一种以αβγ三聚体存在并与GDP结合，为非活化型；另一种构象是α亚基与GTP结合并导致βγ二聚体的脱落，此型为活化型。功能：1、调节腺苷酸环化酶活性；2、调节视网膜cGMP磷酸二酯酶活性。3、调节磷脂酶C活性，促进IP3与DG的生成；4、调节离子通道。
4.第二信使（secondary messenger）：在细胞内传递细胞调控信号的化学物质称为细胞内信息物质。通常将cAMP、cGMP、IP3、DG、Ca2+等这类在细胞内传递信息的小分子化合物称为第二信使。第二信使在传递信号时绝大部分通过酶促级联反应方式进行。它们最终通过改变细胞内有关酶的活性、开启或关闭细胞膜离子通道及细胞核内基因的转录，达到调节细胞代谢和控制细胞生长、繁殖和分化的作用。
5.钙离子调节素（calmodulin,CaM）: 钙调蛋白（CaM），是由一条多肽链组成的单体蛋白。可结合4个Ca2+，胞浆Ca2+浓度≥10-2mmol/L时，Ca2+与CaM结合，构象改变而激活Ca2+ -CaM激酶。
6.增强子(enhancer)：远离转录起始点（１～３０kb）、决定基因的时间、空间特异性表达、增强启动子转录活性的DNA序列，其发挥作用的方式通常与方向、距离无关。增强子也是由若干功能组件——增强体（enhanson）组成，是特异转录因子结合DNA的核心序列。增强子的作用特点：①增强子提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离作用(1－4kb、30kb)，在基因的上游或下游都能起作用。②增强子作用与其序列的正反方向无关。③增强子与启动子在结构、功能上密切联系，要有启动子才能发挥作用,但对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。④增强子的作用机理虽然还不明确，但必须与特定的蛋白质因结合后才能发挥增强转录的作用。增强子一般具有组织或细胞特异性，是由这些细胞或组织中具有的特异性蛋白质因子所决定的。
7.基础转录装置（basical transcriptional apparatus）：在TFⅡA～F等参与下，RNA聚合酶Ⅱ与TFⅡD、TFⅡB等聚合，形成一个功能性的前起始复合物PIC，可以开始转录但其速率低，因此称为基础转录装置。7.重叠基因（overlapping gene）: 是一种转录单位，一个基因可决定多种mRNA和蛋白质。它们可以有2个启动子，2个终止子，几个外显子。转录时，可能使用2个启动子中的1个或2个，也可能使用2个终止子中的1个或2个，或用不同的剪切方式对转录的初级产物进行加工，产生多种mRNA中的一种。如Bcl-X基因 。
8.假基因(pseudogene)：在多基因家族中，不产生有功能基因产物的基因。即序列与有功能的基因相似，但或者不能转录，或者转录后生成无功能的基因产物。用Ψ表示。造成原因是基因在进化过程中，发生突变所致（如缺失、倒位、点突变等）。假基因往往缺少正常基因的内含子，两侧有顺向重复序列。
9.RNA干扰：siRNA是一类长21—25个核苷酸的双链RNA，产生于病毒感染或其他双链RNA诱导以后，其功能是引起特异的靶mRNA降解，以维持基因组稳定，保护基因组免受外源核酸入侵和调控基因表达等，这一细胞反应过程叫做RNA干扰（RNAi）。
10.酵母双杂交：酵母双杂交是一种新的遗传体系，它是以酵母菌的基因分析为基础，用它在体内研究蛋白质与蛋白质相互作用的实验方法。双杂交系统是在酵母菌体内用于研究蛋白质相互作用的实验方法，能用于鉴定已知蛋白质之间的相互作用，可对蛋白质的作用部位及关键片段做准确定位，可以从cDNA文库中筛选出与所研究蛋白质相互作用的蛋白质及其编码基因。并逐渐推广应用到其他一些研究领域如：细胞周期调控，转录调节和信号传导等。
11.转录因子 （transcription factor）：转录调节因子由某一基因表达后，通过与特异的顺式作用元件相互作用（DNA-蛋白质相互作用）反式激活另一基因的转录，故称反式作用因子（trans-acting factor）。
12.转录因子（transcription factors，TF）的结构：DNA结合域(DNA binding domain)、转录激活域(activation domain)、蛋白质－蛋白质相互作用结构域（如二聚化结构域）。（1）DNA结构域：通常由６０～１００个氨基酸残基组成。A、锌指(zinc finger)结构。B、碱性螺旋－环－螺旋(basic helix-loop-hlix，bHLH)。C、碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper，bZIP)。（2）转录激活域：由３０～１００个氨基酸残基组成。转录激活域又有酸性激活域(acidic activation domain)、谷氨酰胺富含域(glutamine-rich domain)及脯氨酸富含域(proline-rich domain)。（3）二聚化结构域：二聚化作用与bZIP的亮氨酸拉链、bHLH的螺旋－环－螺旋结构有关。
13.衰减子（attenuator）：细菌E.coli的trp操纵子中第一个结构基因与启动序列P之间有一衰减子区域。Trp操纵子的序列1中有两个色氨酸密码子，当色氨酸浓度很高时，核蛋白体（核糖体）很快通过编码序列1，并封闭序列2，这种与转录偶联进行的翻译过程导致序列3、4形成一个不依赖ρ（rho）因子的终止结构---衰减子。(转录衰减是原核生物特有的调控机制)。
14.DNA的体外重组：DNA的体外重组是指含有特异目的基因的DNA片段与载体DNA在试管内连接的过程。常用的方法：1. 粘性末端连接法；2. 平末端连接法；3. 结尾法；4. 人工接头法（linker）。
15.限制性核酸内切酶（restriction endonuclease, 内切酶）：是一类特异性地水解双链（ds）的DNA的磷酸二酯酶。分Ι、II、 Ш 型。内切酶的用途： 1.制作DNA物理图谱； 2.DNA限制性片段长度多态性分析（RFLPS）。 3.基因克隆及亚克隆； 4.DNA杂交与序列分析； 5.基因组同源性研究； 6.基因突变和化学修饰的研究。
16.转化（transformation）：在基因克隆技术中，将质粒DNA及其重组体导入细菌，称为转化。转染（transfection）：病毒及其重组体导入受体细胞，称为转染。转导（transduction）：噬菌体及其重组体导入受体细胞称为转导。
17.感受态细胞（copetent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
18.单顺反子（monocistron）：真核基因转录产物为单顺反子，即一个基因编码一条多肽链或RNA链，每个基因转录有各自的调节元件。
19.癌前基因（proto-oncogene）：人们将存在于正常细胞中的癌基因的同源性序列称为原癌基因，也称为细胞癌基因，原癌基因是细胞的正常基因，它们在胚胎期表达，对细胞的正常生长分化和凋亡起着重要的调节重用。原癌基因被某种因素激活，则成为具有转化细胞活力的癌基因。
20.包装细胞（pakaging cell）：包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因gag、pol、env所编码的蛋白，为逆转录病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA，一句话，包装细胞本身不能产生任何形式的病毒颗粒。
21.基因敲除(gene knockout): 将细胞基因组的某一序列克隆并加以改造后重新导入细胞中,这一序 列就可以与基因组内的同源序列发生重组,从而将改造后的基因置换到基因组内,实现基因的定位突变.可以用正常基因敲除突变的基因,以进行性状的改良和遗传病的治疗,又可以用突变的基因敲除正常的基因,以研究 此基因在发育和调控方面的作用.
22.“自杀基因”的基因治疗：也称活化前体药物性基因治疗。某些病毒或细菌产生的酶能将对人体无毒或低毒的药物前体，在人体细胞内一系列酶的催化下转变为细胞毒性物质，从而导致细胞死亡。
23.基因治疗的总体策略：基因治疗是通过在适当的靶细胞中有效表达重组目的基因片段而实现的。目前设计基因治疗策略的总体原则是：1.直接补替缺陷的基因；2.抑制非正常的基因产物表达；3.以间接方式调节机体本身免疫系统的抗病功能；4.利用外源基因对病变细胞造成特异性杀伤。种类：1.基因替代和基因矫正治疗：基因替代是指正常基因原位替代缺陷基因（或变异基因）。基因矫正是指将致病基因的异常碱基序列进行纠正，而正常序列部分予以保留。2.代偿性基因治疗：通过对有代偿功能的基因的正调控，开启其关闭状态来代偿功能异常的基因。例如，以某些作用剂提高珠蛋白基因的表达以治疗ß地中海贫血。3.基因补偿性治疗：基因补偿性治疗指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得以加强。目前基因治疗多采用此种策略。4.基因失活性治疗：基因失活性早期一般指反义核酸技术。它将特定的反义核酸，包括反义RNA、反义DNA和核酶导入细胞，在翻译和转录水平阻止某些基因的异常表达，以达到治疗疾病的目的。RNAi、肽核酸、基因敲除。5.调控性基因治疗：通过导入编码调控蛋白的基因以治疗基因表达异常的疾病。如：以野生型P53基因治疗肺癌或急性白血病。6.应用“自杀基因”的基因治疗：也称活化前体药物性基因治疗。某些病毒或细菌产生的酶能将对人体无毒或低毒的药物前体，在人体细胞内一系列酶的催化下转变为细胞毒性物质，从而导致细胞死亡。7.免疫修饰性基因治疗：免疫修饰性基因治疗即导入能使机体产生抗病毒或抗肿瘤免疫力的基因以达到治疗目的。例如：B7共刺激分子基因及各种淋巴细胞因子基因的导入和表达，直接注入抗原基因等。8.化疗保护性基因治疗：向正常细胞内导入单相或多相细胞毒性药物的抗性基因，使得正常细胞耐受化疗药物的能力大大提高。如：导入多药耐药基因（MDR），可使正常细胞获得广泛的化疗药物耐受性。9.特异性细胞杀伤性基因治疗：利用DNA重组技术构建以特异性杀伤靶细胞为目标的导弹。具有导向性和杀伤性。
24.基因治疗的基本程序：（一）获得目的基因：要进行基因治疗，必须首先获得目的基因并对其表达调控进行详细研究。目的基因来源有多种，主要包括：含目的基因的供体细胞的基因组DNA分离、预先分离克隆的基因、PCR扩增的基因及人工合成的基因。（二）靶细胞的选择：已被应用的靶细胞有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌细胞及肿瘤细胞。1.发病器官及位置：可以选择病变本身器官的细胞，也可以选择病变器官以外的细胞来作为基因治疗的靶细胞。2.靶细胞应容易取出和移植；3.靶细胞容易在体外培养。4.靶细胞容易实现基因转化。将目的基因转移到靶细胞的手段主要有物理、化学、融合及病毒载体四大类。5.靶细胞应有较长的寿命。（三）基因载体和基因转移系统：目前使用的基因载体有病毒载体和非病毒载体。1.非病毒介导的基因转移：①物理方法：• 显微注射法；•电穿孔法；•直接注射法和微粒子轰击法。②化学方法：• DNA-磷酸钙共沉淀法； 多聚阳离子-DNA复合物法；• 脂质体-DNA复合物法。③ 融合法：通过原生质球相互融合的方法，将目的基因导入靶细胞。2.病毒介导的基因转移：该类方法是以病毒为载体，将目的基因导入靶细胞或器官，并使之表达。一般在基因转移中，所使用的病毒载体都是经过改建的有复制缺陷的病毒。这些病毒缺失了其自身复制所必需的一些基因，然后将治疗基因、一些基因的调控成分（如启动子和增强子）以及polyA信号等插入，使之成为表达性载体。目前在基因转移中所使用的病毒载体有以下几种。1.逆转录病毒（retrovirus,RV）： RV是目前基因转移中应用最为广泛的一类病毒。是一类RNA病毒。由于缺失了自身包装所必需的蛋白（结构蛋白gap，多聚酶pol，包膜糖蛋白env）基因，因此其复制需依赖辅助细胞系。逆转录病毒转染效率高，理论上可高达100%。转染后，前病毒基因组（经反转录后形成的DNA）可与靶细胞基因组随机组合，因而能稳定的表达外源基因。缺点：1）只能转染处于增殖状态的细胞；2）携带的外源基因不能太大（8-10Kb）；3）逆转录病毒的感染依赖于靶细胞表面适宜受体存在，限制了它的应用，尤其是体内基因治疗的应用；4）理论上讲，从包装细胞释放出的复制缺陷的逆转录病毒只有一次性感染靶细胞，但在某种情况下也会造成野生型病毒的爆发。5）由于病毒基因组是随机整合到靶细胞基因组的，因而具有致细胞癌变的可能；6）逆转录病毒不能耐受纯化和浓缩等处理过程，否则会使其感染活性大大下降。逆转录病毒载体的构建：外源基因插入病毒基因组有两种方式，一种是直接将外源基因插入到病毒基因中；另一种是以外源基因取代病毒的必需结构基因。在复制缺陷型病毒中，外源目的基因的插入使病毒基因灭火或以目的基因取代病毒的必需基因，使产生的重组前病毒不能表达病毒结构蛋白，因此转录产生的RNA不能被包装产生子代重组病毒，必须借助辅助病毒的共感染或通过包装细胞提供病毒复制所必需的反式作用蛋白，然后才能包装产生子代重组病毒。这样获得的子代重组病毒仅仅具有一次感染性，避免了产生继发扩散感染的危险。包装细胞（pakaging cell）：包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因gag、pol、env所编码的蛋白，为逆转录病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA，一句话，包装细胞本身不能产生任何形式的病毒颗粒。逆转录病毒载体介导基因转移的一般过程：1）目的基因克隆到逆转录病毒载体上；2）带有目的基因的逆转录病毒载体通过物理方法如磷酸钙介导或电穿孔法导入已选定的包装细胞；3）根据载体所提供的筛选标记基因筛选转化细胞；4）选择具有高滴度重组病毒的转化细胞，分离重组病毒；5）重组病毒感染靶细胞，采用两种方式，一种是以无细胞带病毒上清和靶细胞一起温育；另一种以产病毒的包装细胞经射线照射致死后作为饲养细胞，被靶细胞在其上面培养达到目的。6）如采用体外感染，则将感染的细胞回输体内，分析治疗基因的表达及治疗效果；7）病毒感染的质量控制，在基因转移过程中要进行严格的质量控制。基因转移的方法和途径： 逆转录病毒载体系统进行基因转移的方法主要有in vivo和ex vivo两种。基因治疗的早期多采用离体方案。离体方案基因转移效率高，具有明确的基因转移，但必须进行宿主细胞的体外分离培养，而大多数人体组织细胞，原代培养比较困难。近年来，更多采用体内方案。重组逆转录病毒直接注射的途径主要有：1）采用静脉注射等途径，将重组病毒直接注射到机体内，通过重组病毒的感染作用实现基因转移；2）直接将产生重组逆转录病毒载体的包装细胞注射到组织或肿瘤中，由包装细胞释放再感染靶细胞；3）直接将表达载体，可以是非病毒性表达质粒，注射到人体内，如将HIV-1病毒载体注射到肌肉内，使其表达相应的env基因蛋白，引起相应的细胞免疫。2.腺病毒（adenovirus,AV）： AV是一些大的（约38kb）双链DNA。目前作为基因治疗中所用的AV载体通常是一些复制缺陷病毒，其基因缺失位于基因组的E1A-E1B或E3区。AV既能感染增殖期细胞，也能感染静止期细胞。这类病毒比较稳定，且浓缩和纯化对其感染活性影响不大。其不足之处为：1）病毒基因组一般不与靶细胞基因组整合，因而其表达外源基因是暂时的和不稳定的；2）在AV的生活周期中，有许多不同生物学活性的蛋白暂时表达，其中也包括一些与细胞恶性转化相关的蛋白；3）感染细胞内大量病毒蛋白的表达，可导致机体对受染细胞的强烈免疫应答。这一毒副作用在体内基因治疗是必须引起足够的重视。目前有报道利用Cre——loxp重组构建“无内脏（gutless）”AV载体可望解决AV的免疫原性问题；4）AV几乎可以感染所有细胞，缺乏特异性。或许可以通过使用组织特异性启动子来克服这一问题。3.腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）:AAV属于微小病毒家族成员，是一类小的单链DNA病毒（基因组约4.7kb），非常稳定。本身无致病性，需辅助病毒（常为AV）存在时才能复制。AAV可感染人的细胞，并能整合至非分裂相细胞。大部分AAV基因组可去除，从而可使外源基因得以大量补足。AAV可以整合进入宿主细胞基因组，但不如RV的整合效率高。有趣的是，在感染细胞中，野生型AAV基因组可高效定点整合于人类第19号染色体长臂的特定位置上，这种整合可导致染色体基因重排，而这种重排与慢性B淋巴细胞白血病相关。然而携带治疗性基因的AAV载体似乎不象它的野生型亲本，没有定点整合于19号染色体的相同特征。因此从安全的角度来考虑，这种AAV的定点整合有多大优越性，尚值得进一步探讨。4.单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）:HSV是一些双链DNA病毒（基因组约150kb），具有嗜神经细胞的特性，能在神经细胞内形成“终生隐性感染”。将外源基因导入并使之长久存在于中枢神经系统是该类病毒载体的一大特点。如果能够选择性地调节目的基因的表达，而不诱导病毒基因的表达，这将对中枢神经系统疾病的基因治疗大有帮助。HSV的缺点：1）仅能感染分裂细胞，从而使之在成人脑组织中的应用受到限制。2）这类病毒（包括无复制能力的病毒）对靶细胞具有毒害作用，需慎重。（四）外源基因表达的检测： 需用载体中的标记基因对转化细胞进行筛选。在较多的表达载体中都有neor 标记基因的存在，若向培养基中加入药物G418，未被转化的细胞则因不存在neor 标记基因而不能存活。（五）回输体内： 将治疗性基因修饰的靶细胞以不同的方式回输体内以发挥治疗效果。如淋巴细胞可以静脉回输入血；造血细胞可采用自体骨髓移植的方法；皮肤成纤维细胞经胶原包裹后埋入皮下组织中。
25.分子克隆的基本步骤：•①外源DNA（目的基因）的制备，②•克隆载体的制备，•DNA的体外重组，③•重组体转入受体细胞，④•重组体的筛选与鉴定，⑤•外源基因在转化细胞中的表达。
外源基因的制备：.从生物基因组分离目的基因：①•利用基因文库筛选目的基因。基因组文库的概念。“鸟枪法”。 cDNA文库的概念 ? ②•利用mRNA或cDNA钓取目的基因；③•利用物质性质差别分离目的基因： G-C碱基对比A-T重，可用密度梯度离心分离之。2. 利用基因表达产物来获取目的基因：•使用探针从cDNA文库中筛选目的基因。 cDNA文库的完整性。3.用酶学或化学方法合成目的基因：①•逆转录酶法合成目的基因，②•PCR法合成目的基因，③•化学合成目的基因：胰岛素基因、干扰素基因等市场化。目的基因的来源：1. 基因组DNA的非特异性断裂；2. 染色体DNA的限制性内切酶酶解；3. 通过mRNA合成cDNA；4. 人工体外合成DNA片段；5. PCR扩增特异性基因片段。常用的载体（vector）：理想载体应具备：1）具有能自主复制的复制子；2）外源基因插入后不影响其复制能力；3）其裸露的DNA能感染宿主细胞；4）对多种限制性酶有单一的切点；5）能赋予宿主细胞易于检测的表型；6）分子量小，多拷贝。目前常用的载体多是人工构建的：质粒、噬菌体或病毒：1. 大肠杆菌质粒载体，严紧型和松弛型：1）pBR系列质粒： pBR322、pBR325、pBR313等人工载体；2）pUC系列质粒： Puc18、19、118、119等人工载体。2.粘性质粒（Cosmid）：克隆容量较大，如pHC79可以克隆长达45kb的外源性DNA。最适宜建立基因文库。3. 噬菌体载体：λ噬菌体，为双链线性DNA分子，约50kb。也最适宜建立基因文库：①•Charon系列载体，②•EMBL 系列载体，③•λgt 系列载体。4. 病毒载体：在真核细胞，DNA或RNA病毒载体。SV40病毒，痘苗病毒，腺病毒和反转录病毒等。5. 酵母菌载体：酵母菌是表达真核细胞基因的较为理想的受体细胞。缺点：不稳定，易丢失。DNA的体外重组：DNA的体外重组是指含有特异目的基因的DNA片段与载体DNA在试管内连接的过程：1. 粘性末端连接法；2. 平末端连接法；3. 结尾法；4. 人工接头法（linker）。重组体引入受体细胞：①•转化（transformation）②•转染（transfection）③•受体细胞分原核细胞和真核细胞④•感受态细胞（copetent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。重组克隆的筛选与鉴定：转化子与非转化子，重组子与非重组子。阳性克隆筛选：一、平板筛选：1. 插入失活法； 2. 插入表达法（β—半乳糖苷酶显色反应）。二、电泳筛选；三、核酸分子杂交筛选法：1. 原位杂交（in situ hybridization）， 2. Southern杂交， 3. Northern杂交。四、核酸序列测定法