Literature
首页医源资料库医源图书馆教材类中国幽门螺杆菌研究

幽门螺杆菌长期保存后染色体DNA酶切图谱的分析

来源:中国幽门螺杆菌研究
摘要:幽门螺杆菌长期保存后染色体DNA酶切图谱的分析幽门螺杆菌是近年来从人体胃组织中发现的一种细菌,与胃和胃溃疡的发生有密切关系,而空肠弯曲菌则是近十年来国内外学者较为注意的腹泻致病菌,这两种细菌营养要求及培养条件均较高,特别在菌株保存方面,至今还存在不少问题,为了更好地开展这些疾病的基础研究,我们对不同......

点击显示 收起

幽门螺杆菌长期保存后染色体DNA酶切图谱的分析

  幽门螺杆菌是近年来从人体胃组织中发现的一种细菌,与胃和胃溃疡的发生有密切关系,而空肠弯曲菌则是近十年来国内外学者较为注意的腹泻致病菌,这两种细菌营养要求及培养条件均较高,特别在菌株保存方面,至今还存在不少问题,为了更好地开展这些疾病的基础研究,我们对不同种类的弯曲菌,在20%小牛血清布氏肉汤和全羊血中保存,于不同时间检查了存活情况、生物学特性及染色体DNA的酶切图谱,实验证明,用这种方法保存,在存活率、菌体形态、生物特性保持较好,染色体DNA酶切带型前后保持一致。

  1 材料和方法

  1.1 菌株 幽门螺杆菌自各型胃病患者的胃粘膜中分离,共15株。空肠弯曲菌由国内不同地区分离,共34株(其中人源菌11株,鸡源菌8株,鸭源菌6株,鹅源菌4株、猪源菌2株、羊源菌3株),另外从比利时引进空肠弯曲菌3株(Cj22,32,26),结肠弯曲菌2株(Cc25,29)及海鸥弯曲菌3株(Cl34,35,36)和分子量测定用经过HindⅢ酶解的标准γ噬菌体DNA。

  1.2培养基 试验用培养基用改良布氏琼脂及布氏肉汤均按参考文献配制。

  1.3 染色体DNA提取 弯曲菌经37°C48h在混合气体(10%CO2,5%O2,85%N2)条件下培养,每个平皿20mlT.E洗菌,置30ml的离心管,经5000rpm/分离心10min,弃上清,沉淀用10mlT.E悬浮,加10%SDS1.5ml于65°C水浴中1h;用酚抽提3次,酚/氯仿异戊醇抽提5次以上,再用氯仿抽提2次;然后透析)T.Hp8.0)24h以上,换T.E4次,用玻棒缠绕经异丙醇沉淀的DNA,再用75%乙醇浸泡2次,每次10min,将坡棒倒插,DNA向上,室温中凉干;用800μlT.E将玻棒上的DNA洗入小离心管中,于-20°C中保存。

  1.4 弯曲菌染色体DNA酶切 用PstⅠ,HindⅢ E.coRI,Bg1Ⅱ,XbaⅠ五种酶进行试验,各种酶均购自中国医学科学院基础医学研究所。

  2 结果

  2.1 过氧化氢酶阳性弯曲菌的生物学特性

  对于-70°C条件下保存不同时间的弯曲菌主要生物学生物学特性:生长温度,1%甘氨酸的生长,对萘啶酮酸敏感性,尿素酶活必以及马尿酸水解,进行了检查与比较,基本特性与初分离时相同,其结果见表1。

表1 过氧化氢酶阳性弯曲菌经-70°C保存后生物学特性

菌株 生长温度 1%甘氨酸生长 对萘啶酮酸抗性 尿素酶试验 马尿酸水解
25℃ 37℃ 43℃

幽门螺杆菌

+

+

+

空肠弯曲菌

+

+

+

+

结肠弯曲菌

+

+

+

海鸥弯曲菌

+

+

+

+

  以上结果表明在-70C条件下保存,弯曲菌复苏快,性状稳定。

  2.2 弯曲菌于低温(-70°C)条件下存活检查

  各种弯曲菌在布氏血琼脂中,经10代以目上传代稳定后,一般在混合气体条件下,于37°C经24h~48h培养后,均能见到较为丰富的生长,经涂片作0.3%复红单染色,镜检一般均能见到生长典型的弯曲菌,然后用Eppendorff离心管加1ml20%小牛血清布氏肉汤(或全羊血),将培养物用白金耳直接刮到小管内,形成浓厚的菌液,以后将小管在-20°C中预冻,次日再保存在-70°C中,经不同时间检查存活情况,结果如表2。可见在3~10个月内于-70°C条件下,全部存活,以上保存方法简便,易行,可作为弯曲菌保存。

表2 各种弯曲菌经-70°C低温保存后检查

菌株 存活情况 菌形检查
7D 15D 1月 2月 3月 6月 10月
人源株

11/11

11/11

11/11

11/11

11/11

11/11

11/11

典型海鸥翅样或弧形弯曲菌,极少数作球状
C.jejuni鸡

8/8

8/8

8/8

8/8

8/8

8/8

8/8

空肠鸭

6/6

6/6

6/6

6/6

6/6

6/6

6/6

弯曲菌鹅

4/4

4/4

4/4

4/4

4/4

4/4

4/4

2/2

2/2

2/2

2/2

2/2

2/2

2/2

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

H.pylori胃炎及幽门弯曲菌溃疡病患者

15/15

15/15

15/15

15/15

15/15

经分离传代可见40%~95%典型弯曲菌,有的作小球状
对照组 空肠弯曲菌 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 菌形较典型的弯曲状
结肠弯曲菌 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2
C.coli
海鸥弯曲菌 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3
C.laridis

  2.3 经传代冷冻保存后,弯曲菌染色体DNA酶切图谱检测

  2.3.1 空肠弯曲菌染色体DNA酶切 实验分两步进行 ①取空肠弯曲菌E3、E4(鹅源菌),G891(鸡源菌),流羊27(羊源菌)的染色体DNA,分别用三种内切酶进行消解(HindⅢ、PstⅠXbaⅠ)各管于37°C水浴中,作用1.5h,然后进行电泳,电泳在稳压下进行,电压为50V,电泳完毕后将琼脂糖凝胶(E.B加在凝胶中)置紫外灯下观察,并照像。②经初步试验后,又取适宜的PstⅠ进行消解,获得前后对比较好的结果。

  2.3.2 幽门螺杆菌染色体DNA酶切 幽门螺杆菌自三种不同胃病患者的胃粘膜中分离,Cp397(慢性胃炎、溃疡病),Cp400(十二脂肠球溃疡),Cp407(浅表萎缩性胃炎),提取染色体DNA后,用Bg1Ⅱ进行酶解,各管于37°C水浴中,作用2.5h电泳40V.2h后30V17h,电泳后将琼脂糖凝胶(E.B加在凝胶中)置紫外灯下观察照像。可以看出用HindⅢPstⅠey XbaⅠ对不同弯曲菌酶切图谱有所不同,但其中以PstⅠ酶切的带型较清晰,还可看到四株不同来源的空肠弯曲菌及三株幽门螺杆菌,在较为长期保存后,染色体DNA酶切图谱带型完全一致。

  3 讨论

  弯曲菌菌种保存,对于深入开展对本菌的研究,有着非常重要的意义,文献上介绍的方法不多,幽门螺杆菌用全血或加20%小牛血清布氏汤或加入各种添加剂进行保存,但时间均不太长,Drum等用10%小牛血清布氏汤液体培养物,经24h培养后,添加50%甘油及小牛血清,于-70°C中能存活6个月;空肠弯曲菌用50%卵黄盐水,使用时,接种一白金耳菌苔,置微氧罐内,增殖24h,换上橡皮塞,置35°C温箱中,可保存5个月之久,在布氏肉汤内于-20°C中可存活2个月;15%甘油布氏肉汤中,在-70°C中可存活半年,但以上方法所保存的菌株,均不能获得完全存活;而我们所用的10%的小牛血清布氏肉汤,将24h~48h的新鲜菌苔,直接刮到保存的Eppendorff离心小管中,每管加培养基1ml,不需重新培养,可直接置-20°C中预冻,过夜后,再于-70°C中作长期保存,细菌染色体DNA限制性内切酶分析,可应用于流行病学调查及菌型的鉴定,同型的菌株应该有完全相同的染色体DNA酶谱;实验证明经这种方法对弯曲菌保存后、其生物学特性及染色体DNA酶切图谱的检查,均获得性状的前后一致,因此,这是一种比较简易可行的保藏方法,但对更为长期的保存,仍需作进一步的研究。

陈晶晶1 蒋秀高1庄弢1 甘毓麟2 齐强2 李文东2

1中国预防医学院科学院流行病学微生物学研究所(北京 102206)

*国家自然科学基金资助课题

作者: 2006-1-13
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具