6-5 真菌的遗传分析

　　一、链孢霉（Neurospora crassa）的生活史

　　链孢霉有两种繁殖方式，一种是无性繁殖，当其孢子（N）或菌丝落在营养物上，孢子萌发，菌丝生长形成菌丝体（N）。另一种是有性繁殖，两个亲本必须是不同的交配型（matig type）A和a，各自的分生孢子会散落在不同交配型子实体的受精丝上，进入子实体，进行核融合，形成2n核，（A/a）。二倍体时期十分短暂，很快进行减数分裂，最后再经过一次有丝分裂，在子囊中产生8个单倍体的子囊孢子，子囊孢子成熟后有可萌发，长成新的菌丝体（图5-9）。

　　链孢霉后代多，样本大，统计分析的误差小，生活周期段短，在短时间内可获得结果。链孢霉易培养和操作，可利用选择培养基筛选各种突变型；链孢霉又属真核生物，可作为真核的研究模型，因此是很好的遗传学实验材料。子囊孢子是单倍体，不存在显隐性的问题，表型和基因型一致；孢子按顺序排列在子囊中，我们称其为顺序四分子（ordered tetrad），经过分析易于确定是否是重组类型及基因的转变，其着丝粒本身也可看作是一个位点来研究，因此在四分体时期进行遗传分析是很方便的，这种方法称为四分子分析（terard analysis）

　　二、着丝粒作图

　　链孢霉的野生型又称为原养型（prototroph），在基本培养基上就能生长，子囊孢子按时成熟呈黑色。有一类突变型是不能合成某些物质，称为营养缺陷型（auxotroph），在基本培养基上不能生长。如赖氨酸缺陷型是自己不能合成赖氨酸，因此培养时必须在基本培养基上加入适量的赖氨酸，此种缺陷型才能生长。缺陷型比野生型的子囊孢子成熟得慢，所以镜检时突变型的子囊孢子呈白色，和黑色的野生型子囊孢子很容易分辨（图5-10）。

　　(一) 第一次分裂分离

　　在同源染色体上如果有一对等位基因A和a，如果交换发生在A和着丝点之外，那么在第一次减数分裂时A和a就完全分开进入不同的两极，至于各向哪一极移动是随机的，但一旦确定就决定了以后子囊孢子排列的位置。第二次减数分裂时，染色单体各自分开，分别进入4个孢子，进一步有丝分裂形成了8个子囊孢子，野生型为黑色，营养缺陷型为白色，4黑4白有序排列（图5-9 ），这种类型表明在A和着丝点之间未发生交换，或没有有效的交换。此称为第一次分裂分离（first division segregation）。

　　(二) 第二次分裂分离

　　和上面的情况相反，若在A基因和着丝点之间发生了一次交换，那么第一次减数分裂时，一对同源染色体的两条姊妹染色单体携带了A和a，进入同一个子细胞，A和a没有分离，同样它们趋向两极时是随机的，直到第二次减数分裂形成四分子时，着丝粒也分开，A和a才分开，各自进入一个子囊孢子中，故称为第二次分裂分离（second division segregation）。第二次分裂时A和a趋向哪一级也是随机的，一旦确定就决定了最后的8个子囊孢子的排列方式。由于第一次和第二次减数分裂的随机性，最后8个子囊孢子的排列有几种不同的组合（图5-13），但决不会是4黑4白，总是两两相间。第二次分离表明在标记基因和着丝粒之间发生了一次交换。

　　(三) 着丝粒作图（centromere mapping）

　　就是利用分裂分离来确定是否重组，再来计算标记基因到着丝点之间的图距。计算公式为：重组率=(交换型子囊数/总子囊数)×1/2×100％

　　这一公式和真核生物的重组率的计算原理相同，都是计算重组型占后代总数的比。本公式为什么乘1/2呢？因为我们统计的单位不是子囊孢子，而是子囊一个子囊中含有8个子囊孢子，它们来自四条染色单体，即使是重组型的子囊里面含的四条染色单体中也只有两条发生了交换，还有两条未发生交换，所以必须乘以1/2 。

　　三、链孢霉的连锁作图

　　链孢霉中有两种缺陷型，一种是nic（nicotinic），不能合成烟酸；另一种是ad（adenine），不能合成腺嘌呤，培养时必须在培养基中分别加入烟酸和腺嘌呤。将这两个品系杂交，杂交后代中得到7种不同的子囊类型（表5-2）。PD为亲二型（parental ditype），意为表型像亲本，共有+ ad和nic +两种类型；NPD为非亲二型，意为表型都不像亲本，有+ +和nic ad两种类型；T为四型（tetratyne），意为有四种基因型+ +，nic ad，+ ad，nic +。

　　事先我们并不知道nic和ad基因是连锁的，通过四分体分析我们不仅能确定这两个基因是否连锁，而且如果连锁的话我们还能确定它们在染色体上的排列顺序，计算出nic和ad与着丝点之间的图距以及nic和ad间的距离。

　　首先我们来看第一种子囊型，从nic和ad两个基因的组合（横向排列）来看，它们是+ad和nic+两种类型，和两个亲本完全相同，故标以亲本二型（PD），这组亲组合的子囊数为808个，占了整个后代子囊数（1000）的80.8%，即大部分为亲组合，少部分为重组合。由此可以判断nic和ad两个标记是连锁在同一条染色体上。我们再纵向来看第一纵行，为+ + nic nic，这种排列方式是符合第一次分裂分离（M I），nic和着丝粒之间为发生交换重组。第二纵行为ad ad + +也属于第一次分裂分离的排列方式，也表明ad与着丝粒之间未发生交换重组。

　　第二种子囊型nic和ad两个基因的组合方式（横向排列）也只有两种类型，++和nic ad，和亲本都不同，故称为非亲二型（NPD）。从纵向来看，第一行的排列方式为+ + nic nic，第二行为 + + ad ad，都属于M I，即两个标记nic、ad与着丝粒之间都未发生交换重组。既然第一类和第二类子囊都未发生重组，那么为什么它们两个标记基因的组合（横向排列）又完全不同呢？这是由于在nic座位和ad座位之间发生了1，4四线双交换（见表中的图）的结果，使得ad与着丝粒之间仍然为第一次分裂分离，实际上是发生了双交换，只是着丝粒与ad座位未发生重组。

　　第三类子囊的两个标记有四种不同的组合方式，成为四型（T），其中第一纵行为+ + nic nic，属于M I，表明nic与着丝粒之间未发生交换重组。而第二纵行就不同了，排列为 + ad + ad ，属于第二次分裂分离（M II），表明在着丝粒和ad之间曾发生过一次交换（1，4二线单交换），才能从第一类亲本的类型变为第三类子囊型。

　　第四类子囊也属于四型（T），但和第三类子囊不同，其第一纵行的排列为+ nic + nic，属第二次分裂分离，第二纵行为ad ad + + 属第一次分裂分离，也就是说nic和ad之间也发生了一次交换，但对于ad和着丝粒之间来说是发生3，4双线双交换，所以虽然发生了交换，但ad标记未发生重组。

　　第五类子囊两个标记的组合只有两种类型，+ ad和nic +，和亲本的组合相同，所以称为PD，但第一纵行和第二纵行的排列都属于MII，即nic与着丝粒之间都发生了一次交换，使这两个座位都发生了重组，实际上在nic和着丝粒之间发生了一次2，3二线单交换，使nic和着丝粒发生了重组，而ad和nic是连锁的。因此也同时发生了重组。

　　第六类子囊型中，两个标记的组合也只有两种 + + 和nic ad，和亲本的都不同，故属于NPD，第一纵行和第二纵行的排列都是属于MII，即nic和ad两个座位与着丝点之间都发生了重组，这种类型的产生较为复杂，从两个标记的组合和纵向的排列来看，是在第四类子囊型交换重组的基础上增加了一次1，4四线双交换（表中的图示），这次双交换发生在nic和ad之间。

　　第七类子囊两个标记有四种组合，即为T，两列纵向排列分别为 + nic + nic和 + ad ad +，都属于M II，即两个标记和着丝粒之间都发生了交换重组。根据两个标记的组合及纵向排列方式不难推测是在第五类子囊型交换重组的基础上产生了1，3三线双交换，这次交换应发生在ad与着丝粒之间。

　　根据着丝粒作图公式我们可以计算出各标记与着丝粒之间的图距。着丝粒与nic座位之间的图距可通过各种子囊型中重组型的子囊数来计算，根据表5-2只有第4，5，6，7型子囊在nic和着丝粒之间才存在MII，即发生交换重组，所以

　　RF（着丝粒-nic）=[(4)(5)(6)(7) /1000]51/25100% =[ (5+90+1+5) /1000]×1/2=5.05%=5.05 (m.u)

　　同理RF（着丝粒-ad）=[(3) (5) (6) (7) /1000]51/25100% =[ (90+90+1+5) /1000]×1/2=9.30 % = 9.30 (m.u)

　　计算的结果告诉我们nic和着丝点之间的距离为5.05图距单位（m.u.）。ad和着丝点之间的距离为9.03图距单位（m.u）。目前知道了nic和ad是在同一条染色体上以及它们和着丝点的距离，但还不知道具体的顺序排列。因根据目前的信息有两种可能：（1）nic和ad分别位于着丝点的两侧；（2）nic和ad位于着丝粒的同侧（图5-14）。究竟属于那一种情况呢？假设两个位点在着丝点的两侧，那么nic和着丝点之间的重组与ad和着丝点之间的重组上各自独立的，也就是说nic和着丝点之间发生一次重组不会影响到ad和着丝点之间的关系；相反，若两个座位都在着丝点的同侧，一旦nic和着丝点之间发生了一次交换，若不存在双交换的话，势必使ad和着丝粒也产生重组。从前面的资料来看，nic和着丝粒之间产生的子囊为（4）（5）（6）（7），共101个子囊，其中（5）（6）（7）型子囊共96个同时也发生了ad和着丝粒之间的重组，表明基本是符合第二种情况，那么为什么有五次不同步发生重组呢？从表5-2中不难看出，不同步的仅为第四种子囊型，两个座位分别为MII、MI，共5个子囊，从重组的图中很清楚地看到是由于在nic和ad之间发生了一次双交换，结果使ad和着丝粒之间未能重组。

　　因ad和着丝粒图距为9.03m.u，nic和着丝粒的图距为5.05m.u，几乎相差一倍，而重组是一个随机的过程，因此ad与着丝粒之间发生重组的交换点可能在着丝点-nic的区域中也可以发生在nic-ad的范围内。若是前者，则nic和ad同时发生重组。ad和着丝粒重组的子囊（MII）共186个，其中nic未同步重组的（MI MII）为90个子囊，近似于ad重组子囊的一半，这和两个座位的距离之比是吻合的。

　　下面我们再来计算nic和ad之间的距离。根据计算重组值的原则： 重组值=重组合/(亲组合+重组合) 5100%

　　那么ad和nic之间的重组依据是什么呢？表5-2已表明两个标记的亲组合只有两种类型 + ad和nic +，不同于这两种类型的子囊都是重组型。因此用下面公式可计算nic和ad之间的图距：

　　RF= (NDD+1/2 T)/ 总子囊数={ [(2) + (6) ]+0.5 [ (3) (4) (7)] }/1000={ (1+1)+0.5 (90+5+5) }/1000=5.2 % = 5.2 (m.u.)

　　NPD的子囊（2和6型）4条染色单体都是重组型的，即整个子囊都是重组型，故无需再乘以0.5，而T子囊中只有一半的染色单体为重组型，故需乘以0.5。

　　从公式计算出nic和ad之间的图距为5.20m.u.，而从图5-10，我们用ad-着丝点之间的图距减去nic-着丝粒之间的图距也应等于nic-ad的图距，即为9.03-5.05=3.98（ m.u.），比用公式计算出的图距要小，或者说着丝粒-ad的图距应为5.05m.u.+5.20m.u.=10.25m.u.，这样就大于前面计算的结果（9.30m.u.）。这是为什么呢？这是由于双交换的存在使着丝粒-ad之间的重组值低估了，从表5-3中可以看出低估的原由。

表5-3 着丝粒-ad间重组值的计算与低估

　　从表中可以看出着丝粒-nic + nic-ad = 202 +208 = 410≠着丝粒-ad（372），这是因为遗漏了38条重组型单体。现在的计算方法不是以子囊数而是染色单体数，所以分母应用子囊数乘4，即低估的重组值为38/451000=0.95，9.30+0.95=0.25m.u.。

　　四、无序四分子分析

　　无序四分子或八分子中孢子没有特殊的顺序，因此也就不能进行着丝粒作图，但无序四分子也可用于各种减数分裂分离和重组分析。现在我们假设酵母有两个基因位点a和b，我们想确定它们是否连锁，如果连锁还要计算a b之间的图距。酵母产生的是无序四分子（图5-15，16），怎样才能用这种四分子来研究连锁呢？首先我们来看看在交换 中有可能产生那几种不同类型的无序四分子，在双杂种中是否有 锁。无序四分子只可能有三种类型（图5-17）：PD、NPD和T型，而且子囊里的孢子是无序的。第一种类型PD看起来好像是两个位点的第一次分裂分离，其实不然。我们可以不考虑其顺序，这些子囊完全是根据它们含有的二种或四种基因型来分类。在后代中二型性（D）基因型可能和亲本相同（PD）也可能不同（NPD），总的类型不会超过PD、NPD和T三种。当两个基因a、b在不同染色体上时，，PD和NPD的四分体不是因为交换而产生，而是由于在减数分裂中期染色体的不同排列所造成的。由于四条染色体在中期板上排列的状态是独立的，一对同源染色体分别向两极的移动是随机的，所以PD和NPD型的四分子的频率相等，NPD应占50％，即重组类型占50％。如果两个基因是连锁的那么结果就不同了。如单交换发生在基因和着丝粒之间，产生四型（T）四分体其频率是有基因和着丝粒之间的距离而定（图5-18）。

图5-18 酵母的无序四分子只可能有三种类型：PD、NPD和T型

　　如果两个基因连锁，各种四分体的类型如图5-13所示，若未发生交换，产生亲二型（PD），如在两个基因间发生一次交换，结果产生两个亲组合和两个重组合的染色体称为四型（T）。若发生双交换的话，仍是亲二型（PD）；若发生三链交换的话，则涉及到四条染色体中的三条，有两种形式：1－3三链双交换和2－4三链双交换，其结果是产生四型的子囊，即两条染色体是重组的，两条染色体是亲组合的。最后一种是四链双交换，产生的子囊是NPD。NPD是4种双交换中的一种，应当比较少。如果PD的频率远远大于NPD子囊的频率，即PD>> NPD，我们就可以推断这两个基因是连锁的。

　　一旦已确定两个基因是连锁的，只要具有各种类型子囊数据的资料，就可以根据作图公式来计算两个基因之间的距离：(重组体的数目/后代的总数) ×100 %

　　现在来看，PD型子囊四条染色单体都是亲组合，而T型子囊有两条染色单体是亲组合，另两条染色单体是重组合；NPD型子囊四条染色单体都是重组合的，那么两个基因之间的重组频率是：(1/2T+PD) /总子囊数×100%

　　例如有200个子囊，140个为PD型，48个为 T型，12个为NPD型，那么两个基因间的重组频率为是：RF＝{[1/2（48）⁺12]/200}×100％＝18％＝18 m.u.

　　这样计算的结果是两个基因间的重组值，并不能反映真实的距离。真实的距离必须考虑到双交换的存在，可以按以下方法分析推算。前面阐述的重组公式中已经表明两个基因间的重组率为ab＝ac⁺bc－2（ac）（bc），也就是说a－b间的真实距离应为a b之间的重组值再加上2次a b之间的双交换值（ac）（bc），或者用a－c之间的单交换值加b－c之间的单交换值，即

　　（a－b）距离＝ab⁺2（ac）（bc）＝ac⁺bc

　　（a－b）SCO⁺2（a－b）DCO＝（a－c）SCO⁺（b－c）SCO

　　SCO：单交换(single crossover)，DCO：双交换(double crossover)

　　资料给我们的仅两个位点，因此无法用（a－c）SCO⁺（b－c）SCO来计算，而只能从（a－b）SCO⁺2（a－b）DCO来着手分析，

　　即 SCO⁺2DCO--------------------（1）

　　无序四分子单交换的产物是T，但另外两次三线双交换也是产生T型子囊，我们无法予以分辨，但我们可以这样来推导：产生T型子囊的单交换类型等于总的T型子囊数减去两种双交换的类型，即

　　SCO＝T－2DCO---------------（2）

　　而一次 DCO＝NPD---------------------（3）

　　但双交换共有四种，那么产生T型子囊的双交换又如何求得呢？我们可以用NPD来推算，因NPD既是双交换的结果又是一种特殊的子囊型，容易区分出来用以计算频率。六种类型中一共有四种双交换，而NPD又占了双交换的1/4，因此整个双交换的频率是：

　　总DCO＝4NPD----------------（4）

　　现将（2）、（3）代入（1）式得：

　　SCO⁺2DCO＝（T－2DCO）⁺2（4NPD）＝（T－2NPD）⁺2（4NPD）＝ T⁺6NPD

　　得到的结果是在此区域内的交换数m，根据霍尔丹方程（图5-5）我们可以将m换算为图距单位。

　　∵RF＝1/2（1－e－m）

　　当m＝0.05时 e－m ＝0.95

　　RF＝1/2（1－0.95）＝1/2×（0.05）＝1/2m

　　当m＝0.10时 e－m ＝0.90

　　RF＝1/2（1－0.90）＝1/2×（0.10）＝0.05＝1/2m

　　m是交换值（霍尔丹的方程的横坐标）；m.u.是重组值（霍尔丹方程的纵坐标），当m＝1时m.u.＝50％，即50m.u.单位。假设在 ab×a⁺b⁺ 杂交中，获得的PD型子囊为56％，T型子囊为41％，NPD型为3％，则

　　RFab＝50〔0.41⁺（6×0.03）〕＝29.5 m.u.

　　再让我们来用这一值和直接从RF中获得的值进行比较，按公式

　　RF＝1/2T⁺NPD＝0.205⁺0.03＝0.235＝23.5 m.u.

　　这个结果比上式少了6m.u.，这是因为在RF分析中漏掉了双交换。

　　五、有丝分裂分离和重组

　　(一) 有丝分裂重组的发现

　　在正常情况下分裂分离和重组都是在减数分裂中发生的，但实验证据表明在有的有机体中交换也可发生在有丝分裂中。第一例有丝分裂交换的例子是由Curt Stern 在1936年发现的，在交换中果蝇的X连锁隐性突变基因黄体色y取代了正常的灰体色基因（图5-19-a），短的曲形刚毛（sn）取代了长的弯的刚毛(图5-19-c)。野生型灰体果蝇的刚毛都是黑色的，而黄体突变果蝇的刚毛则是黄色的。

　　将一个灰体曲刚毛（y⁺sn/y⁺sn）雌果蝇和一个黄体直刚毛（ysn⁺/Y）雄果蝇杂交，Stern发现了正如所预料的那样雌性后代大部分为野生型，但某些雌果蝇的身体有一小块区域是黄色或曲刚毛(图5-19-b)。这个现象被解释为可能是染色体不分离或或染色体的丢失所致。（这些改变是属体细胞的而不是生殖细胞的。）

　　另一些雌果蝇有孪生斑（twin spots），即两个相连的区域，一个为黄色直刚毛，另一个为黑色焦刚毛，呈现镶嵌表型，在孪生斑的周围都是野生型表型(图5-19-b)。Stern注意到一个有趣的现象，即孪生斑的两部分是相连的，那么这种孪生斑一定是某种遗传事件的交互产物。最好的解释是通过有丝分裂交换而产生，Stern熟知在果蝇胚胎分化之后通过有丝分裂产生各种组织，所以他才提出这一解释。

　　 通过有丝分裂交换产生孪生斑如图5-20所示。若有丝分裂发生在着丝点与sn位点之间，那么产生的两个子细胞的基因型将不同，它们进一步分离形成两个相近的克隆时，表现出孪生斑的特点。若交换发生在sn和y之间就会产生单个的黄斑。

　　在很少的情况下，在染色体复制后，但在中期前，同源染色体形成四分体，进行交换，然后再进入中期，复制后的两条染色单体各趋向一极分离，形成了有丝分裂交换。

　　(二) 真菌系统中的有丝分裂重组

　　1. 构巢（Aspergillus nidulans）曲霉菌的生活周期

　　有丝分裂重组研究得较为深入的是真菌。我们将用曲霉属（Aspergillus）为例来说明。曲霉的有丝分裂分析是非常适合的。它的气生菌丝产生长链状的分生孢子（conidia），这是一种无性孢子。每一个分生孢子都有一个单个的核。任何一个孢子的表型都和它的基因型是一致的，这样便于鉴别。若将两个单倍体品系混合，菌丝融合，两种类型的核都同时存在胞质中，这种品系称为异核体（heterckaryon）。和其他品系一样，异核体将产生单核的分生孢子。在少数情况下异核体中的两个单倍体核融合产生一个二倍体核，这一过程称为二倍化（diploidization）。二倍体品系的曲霉产生的无性孢子将具有二倍体核。二倍体细胞是可能要经历有丝分裂交换，产生遗传重组。因为二倍体的核不稳定，最终通过有丝分裂产生单倍体核，此单倍体核含有来自两个单倍体亲本的等位基因的重组。由二倍体核形成单倍体核的过程称为单倍化（hapliodization）（图5-21）。

　　在单倍化中，两个同源染色体自由化时，类似减数分裂，然后随机分离，各趋向一极。这种不同于减数分裂而导致基因重组的系统称为准性生殖系统（parasexual systems）。真菌的准性生殖周期由以下步骤组成：（1）在多核菌丝中形成异核体，（2）在异核体中不同基因型的单倍体核偶尔融合，（3）和单倍体核并排的二倍体融合核中进行有丝分裂交换，（4）二倍体融合核不经过减数分裂而完成单倍化。　

　　2．构巢曲霉的有丝分裂分析

　　进行有丝分裂重组分析时需要构建杂合子供研究。在构巢曲霉中，异核体由两个不同品系构成，然后再筛选出二倍体核。

　　如下面的两个单倍体品系

　　品系1：w ad⁺ pro paba⁺ y⁺ bi

　　品系2：w⁺ ad pro⁺ paba y bi⁺

　　等位基因w，ad，pro，pabay，bi对其野生型等位基因来说是隐性的。表示腺嘌呤（adenine）、对氨基苯甲酸（para-aminobenzoic acid）和生物素（biotin）。这两个品系在基本培养基上都不能生长，但异核体由于基因的互补是可能生长的。

　　w和y等位基因是控制无性孢子的颜色和菌落的颜色，w导致产生白色的孢子，y导致产生黄色的孢子。它们都是隐性突变基因。基因型为w⁺y⁺的品系是绿色的，wy⁺品系为白色，w⁺y品系为黄色，wy品系由于上位效应也是白色的。品系1和2都不是绿色的。然而异核体通常有黄色和白色的孢子混合，而且也有杂色孢子的存在（图 5-22 ），它们的颜色是由其基因决定的。而单倍化后的孢子也有绿色，不难看出这一定是重组的结果（表5-4）。在单倍体中将有一半是白色的，若将白的分离出来，利用选择培养基就可以测出有的位点和亲本的基因型不同，如pro位点，原来白色亲本是pro－，也就是在培养基中一定加入Pro才能生长，而分离出的白色单倍体却有一部分为pro⁺，即不需加Pro就可以生长，这当然是有丝分裂重组的结果，我们将重组类型的菌落数除以总的菌落数就可以得知这两个位点（w和pro）之间的距离。