3-2-6 原核生物的蛋白质生物合成

• 肽链合成的起始
• 原核细胞蛋白质合成的起始过程氨基酸活化（fMet-tRNAMet形成）
• 肽链合成的延长
• 蛋白质生物合成的抑制剂
• 肽链合成的终止

　　氨基酸在核糖体上缩合成多肽链是通过核糖体循环而实现的。此循环可分为肽链合成的起始（intiation），肽链的延伸（elongation）和肽链合成的终止（termination）三个主要过程。原核细胞的蛋白质合成过程以E.coli细胞为例。

　　肽链合成的起始

　　1.三元复合物（trimer complex）的形成核糖体30S小亚基附着于mRNA的起始信号部位，该结合反应是由起始因子3（IF3）介导的，另外有Mg²⁺的参与。故形成IF3-30S亚基-mRNA三元复合物。

　　2.30S前起始复合物（30S pre-initiation complex）的形成在起始因子2（IF2）的作用下，甲酰蛋氨酸-起始型tRNA（fMet-tRNA Met）与mRNA分子中的起始密码子（AUG或GUG）相结合，即密码子与反密码子相互反应。同时IF3从三元复合物脱落，形成30S前起始复合物，即IF2-30S亚基-mRNA-fMet-tRNAMef复合物。此步亦需要fGTP和Mg²⁺参与。

　　3.70S起始复合物（70S initiation complex）形成。50S亚基与上述的30S前起始复合物结合，同时IF2脱落，形成70S起始复合物，即30S亚基-mRNA-50S亚基-fMer-tRNA Met复合物。此时fMet-tRNA Met占据着50S亚基的肽酰位（peptidyl site，简称为P位或给位），而50S的氨基酰位（aminoacyl site，简称为A位或受位）暂为空位。

　　原核细胞蛋白质合成的起始过程氨基酸活化（fMet-tRNAMet形成）

　　关于原核细胞蛋白质生物合成的起始过程讨论以下几点：

　　1.核糖体亚基（30S和50S）：70S核糖体颗粒必须解离为亚基，才能参与形成30S前起始复合物及70S起始复合物，IF3除具有形成三元复合物活性外，也具有使70S核糖体颗粒解离为30S和50S亚基的作用，即解离因子活性（disassociation factor activity）。

　　2.IF：用高浓度的盐（如0.5mol/LKCl）洗涤核糖体，可使核糖体解离为亚基，但这些核糖体亚基在蛋白质生物合成的起始阶段没有活性。后来从盐洗涤液中分离出三种蛋白质因子，当把这三种因子加入盐洗过的核糖体后，核糖体再现了活性，故将这三种蛋白质因子依次命名为IF1、IF2和IF3.在70S起始复合物形成后，无任何IF与之结合。IF的生物学活性见下表。值得一提的是IF1无特异功能，仅具有加强IF2和IF3的活性作用，这种广泛的效应亦称为基因多效性。

IF的性质

　　3.如何正确选择起始密码子

　　1）起始型蛋氨酸tRNA（tRNAMet）和中间型蛋白质氨酸tRNA（tRNAMet）差异tRNA Met具有将甲酰蛋氨酸引入mRNA起始密码子AUG位置的特异功能，而tRNAfMet则将Met引入mRNA分子内部的Met密码子（同样是AUG）处，从另一角度说Met不能被甲酰化，而Met-tRNAMet的Met不能被甲酰化。tRNAMet和tRNAMet在结构上的差异主要有三点，然而，这些结构上的差异，是否就决定二种tRNAMet的特异性，尚无定论。

　　在原核细胞如E.coli细胞，已发现了以Met-tRNAfMet为底物的转甲酰酶。该甲酰基的存在，阻碍了fMet以其α-NH₂与其它氨基酸形成肽键的可能性，从这个意义上讲fMet必然位于肽链的N端。然而，当肽链合成达15-30个氨基酸碱基时，又经蛋氨酸肽酶的作用将N端的fMet水解掉。故肽链合成后，其N端为fMet仅占30%，70%的肽链N端设有fMet。

　　2）IF2能促使fMet-tRNAMet与起始密码子结合，或者说IF2能与tRNAMet反应。相反，IF2不能与tRNAMet反应，而tRNAMet只能与延长因子TU（EF-TU，见下述）反应。在形成30S前起始复合物过程中，必须有IF2参与。因此，IF2与tRNAMet的特异性反应亦有助于保证tRNAMet与起始密码子的结合。

　　3）SD（Shine-Dalgarno）顺序的作用。在mRNA分子中起始密码子的上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，它可以与30S亚基中的16SrRNA3'端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，因此有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始。上述mRNA分子的序列特征1974年由J.Shine和L.Dalgarno发现，故称为SD顺序。后来在E.coli的多种mRNA分子中证实均存在SD顺序。

大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3'-端的互补性

　　肽链合成的延长

　　这一过程包括进位、肽键形成、脱落和移位等四个步骤。肽链合成的延长需两种延长因子（Elongationfactor，简写为EF），分别称为EF-T和EF-G.此外尚需GTP供能加速翻译过程。

　　1.进位即新的氨基酰-tRNA进入50S大亚基A位，并与mRNA分子上相应的密码子结合.在70S起始复合物的基础上，原来结合在mRNA上的fMet-tRNAMet占据着50S亚基的P位点（当延长步骤循环进行二次以上时，在P位点则为肽酰-tRNA）新进入的氨基酰-tRNA则结合到大亚基的A位点，并与mRNA上起始密码子随后的第二个密码子结合。此步需GTP、EF-T及Mg²⁺的参与。

　　2.肽键形成在大亚基上肽酰转移酶（见第四章）的催化下，将P位点上的tRNA所携带的甲酰蛋氨酰（或肽酰基）转移给A位上新进入的氨基酰-tRNA的氨基酸上，即由P位上的氨基酸（或肽的3'端氨基酸）提供α-COOH基，与A位上的氨基酸的α-NH2基形成肽链。此后，在P位点上的tRNA成为无负载的tRNA，而A位上的tRNA负载的是二肽酰基或多肽酰基。此步需Mg²⁺及K⁺的存在。

　　3.脱落即50S亚基P位上无负载的tRNA（如tRNAMet）脱落。

　　4.移位指在EF-G和GTP的作用下，核糖体沿mRNA链（5'→3'）作相对移动。每次移动相当于一个密码子的距离，使得下一个密码子能准确的定位于A位点处。与此同时，原来处于A位点上的二肽酰tRNA转移到P位点上，空出A位点。随后再依次按上述的进位、肽键形成和脱落步骤进行下一循环，即第三个氨基酰-tRNA进入A位点，然后在肽酰转移酶催化下，P位上的二肽酰tRNA又将此二肽基转移给第三个氨基酰-tRNA，形成三肽酰tRNA。同时，卸下二肽酰的tRNA又迅速从核糖体脱落。像这样继续下去，延长过程每重复一次，肽链就延伸一个氨基酸残基。多次重复，就使肽链不断地延长，直到增长到必要的长度。通过实验已经证明，mRNA上的信息的阅读是从多核苷酸链的5'端向3'端进行的，而肽链的延伸是从N端开始的。

　　以下就延长过程讨论四点：

　　1）EF原核生物含有二种延长因子，分别命名为EF-T和EF-G。延长因子是由F.Lipmann及其同事和Allender及其同事于60年代初首先从E.coli细胞分离出的。其中EF-T由EF-Tu和EF-Ts两种成份组成，Tu表示对热不稳定（unstablefortemperature），Ts表示对热稳定（stablefortemperature）。EF-Tu、Ts和EF-G的大约分子量分别为4500.30000和80000。这三种因与GTP（或GDP）均有亲和性。EF-Tu在细胞内含量相当丰富，其拷贝数相当于细胞内aa-tRNA分子的数目。在E.coli细胞中EF-Tu-复合物的稳定性很高，但没有直接活性，EF-Tu只有与GTP形成EF-Tu-GTP复合物才能与aa-tRNA结合。在上述由EF-Tu-GTP的过程中，需EF-Ts的参与。

　　2）核糖体与mRNA的相对移动肽链合成的延长伴随着核糖体与mRNA的相对移动。这种移动最可能是核糖体的主动移位即所谓核糖体机械移动假说。该学说认为机械性移位是核糖体本身固有的，不被任何外部蛋白质因子介导。那么，移位的能量从何而来？在进位和移位二步中的GTP有何作用呢？

　　在延长步骤中核糖体的工作过程中，可有三步获能过程：一是转肽作用，受核糖体本身介导：二是EF-Tu介导GTP水解为GDP和Pi；三是由EF-G介导的GTP水解。根据热力学测定，仅转肽步骤的自由能（△G）的净获得就是相当多的（约7kcal/mol），足以供给核糖体无因子-无GTP反应系统中核糖体的正常工作。现在认为，由EF介导的二步GTP水解的能量主要用于三个方面：[1]在延长步骤中，加速核糖体的循环速度；[2]增强核糖体对抑制剂的抵抗力；[3]有利于翻译有保真性（fidelity）。核糖体机械移动的真正内在机制是什么?现在仍不甚明了。目前的说法有两种：一是将这种移动归因于核糖体等不同成份的构象变化所致；二是认为tRNA在控制核糖体与mRNA的相对移动中也许起中心作用，即mRNA并不能被核糖体一步步移动，而是由于肽酰-tRNA从A位移向P位牵拉的结果。根据这个理论，密码子在联体的移动是由于密码子与反密码子结合之故。支持这个理论的证据是：发现移码性校正tRNAs的反密码子包含有四个核苷酸，能与mRNA的四个核苷酸结合，例如tRNAGly当这些异常tRNA被移位时，被连接的tRNA也向前移动四个核苷酸的位置，说明mRNA的移位是与tRNA的移动直接相关联的。

　　3）核糖体上的"空闲反应"（idling reaction）

　　在50年代，人们就发现，当从培养基中拿走必需氨基酸，使细菌处于严峻环境中时，细菌体内会产生一系列"紧缩控制"（string responses）去应付不利环境。在1979年-1985年期间，Gallant等探讨了这种"紧缩控制"的机制，目前已基本弄清。当氨基酸缺乏时，未负载的tRNA进入核糖体A位，从而导致产生二种效应；一是空载的tRNA与mRNA密码子结合，从而中止蛋白质合成；二是relA基因开放，生成"紧缩控制"因子（stringent factor，简写为SF）SF属一种核糖体相关蛋白质，分子量约77000.SF可促使GTP或GDP与ATP反应，在核糖体工作的"空闲"状态时，合成ppp5'-G-3'pp（鸟苷五磷酸）或pp5'-G-3'pp（鸟苷四磷酸）。反应由ATP提供p-p基。该步反应通常称为"魔斑"（magic spot）。当pppGpp（或ppGpp）生成后，即可抑制RNA聚合酶的活性，进一步使rRNA、tRNA的合成下降，多聚核糖体的数量及聚集状态改变。pppGpp（或ppGpp）的发现和研究，不仅使人们了解了细菌中的一个重要调控机制，而且也为研究tRNA与核糖体A位相互作用提供了一个很好的模型。目前已发现，上述紧缩控制系统在原核细胞中具有普遍性。真核细胞中有无该控制系统，目前暂不能定论。由pppGpp（或ppGpp）引起的一系列紧急反应，主要包括1）节流：如抑制大部分蛋白质、rRNA、tRNA、脂肪、磷脂、核苷酸的合成；抑制糖原水解及糖氧化；抑制多胺吸收；2）开源：如促进lacarahistrp及arg等操纵子开放；通过活化原有蛋白质水解系统，加速蛋白质水解，提供氨基酸，缓解氨基饥饿状态。因此pppGpp（或ppGpp）亦称为"紧缩控制"的多效应分子。从上述可见"紧缩控制"的意义在于使细胞不要浪费性地生成过多的核糖体，并通过"开源节流"去维持生存。产生该反应的关键是无负载的tRNA进入A位，而导致核糖体的"空闲"反应所致。在正常细菌生长期间，pppGpp（或ppGpp）仅有少量产生。生成的这些效应分子可被pppGpp（或ppGpp）焦磷酸酶水解。一些"松弛"突变株没有这种"紧缩控制"，因为这些突变细胞缺乏SF。

　　蛋白质生物合成的抑制剂

　　某些翻译抑制剂是人工合成的化合物，但大多数是从多种微生物培养液上清中提取出的抗生素，可以抗感染或抑制恶性肿瘤的生长。因为某些抗生素能特异地和原核生物核糖体反应，故广泛应用于抗感染的治疗。

　　（1）嘌呤霉素puromycin）嘌呤霉素的结构很类似氨基酰-tRNA，故能与后者相竞争作为转肽反应中氨基酰异常复合体，从而抑制蛋白质的生物合成：当生长着的肽链（或甲酰甲硫氨酸）被转移到嘌呤霉素的氨基上去时，新生成的肽酰-嘌呤霉素会从核糖体上脱落下来，从而终止翻译。因此肽链合成过早终止，而且在此截短的肽链的羧基端连有一分子嘌呤霉素。

　　（2）链霉素（streptomycin）链霉素能与30S-亚基结合从而抑制蛋白质的合成；此30S-链霉素复合体是一种效率很低且很不稳定的起始解离而终止翻译的复合体。链霉素结合在30S亚基上时亦能改变氨基酰-tRNA在A位点上与其对应的密码子配对的精确性和效率。细菌对链霉素的抗性是由于30S小亚基中某一个肽链产生突变之故。

　　（3）四环素（tetracyclines）四环素能阻断氨基酰-tRNA进入A位点，从而抑制肽链的延长；新生的肽链存留在P位点上，并能与嘌呤霉素相反应。

　　（4）氯霉素（chloramphenicol）氯霉素能阻断70S核糖体中的50S大亚基的肽酰转移酶的活性，从而抑制肽链的延长。

　　（5）放线菌酮（cycloheximide）放线菌酮被认为与氯霉素的作用类似，但它主要作用于真核生物的80S核糖体中的60S亚基。

　　（6）红霉素（erythromycin）红霉素与50S大亚基结合，并阻断移位作用因而将肽酰-tRNA"冻结"在A位点上。对红霉素产生抗性是由于50S大亚基中某一个蛋白质产生突变之故。

　　上述各种抗菌素对细菌的完整细胞或无细胞系统均有抑制作用，它们都作用于核糖体循环的起始和/或延长步骤。

　　由于细菌核糖体与哺乳动物线粒体核糖体相似，因上能抑制细菌核糖体功能的抗菌素，往往也能抑制哺乳动物线粒体的核糖体循环。线粒体是一个"半自养"的细胞器，它的蛋白质除由胞浆核糖体循环产生供应外，并有其自身的翻译系统。

　　四环素族类（包括四环素、土霉素、金霉素等）对真核细胞的的无细胞系统蛋白质合成具有抑制作用，但对完整的真核细胞无抑制作用，这是由于四环素族类抗菌素不易透入真核细胞膜。

　　肽链合成的终止

　　肽链合成的终止，需终止因子或释放因子（releasing factor简写为RF）参与。在E.coli中已分离出三种RF：RF1（MW36000），RF2（MW38000）和RF3（MW46000）。其中，只有RF3与GTP（或GDP）能结合。它们均具有识别mRNA链上终止密码子的作用，使肽链释放，核糖体解聚。

　　1.多肽链的合成已经完毕，这时，虽然多肽链仍然附着在核蛋白体及tRNA上，但mRNA上肽链合成终止密码子UAA（亦可以是UAG或UGA）已在核蛋白体的A位点上出现。终止因子用以识别这些密码子，并在A位点上与终止密码子相结合，从而阻止肽链的继续延伸。RF3的作用还不能肯定，可能具有加强RF1和RF2的终止作用。RF1和RF2对终止密码子的识别具有一定特异性，RF1可识别UAA和UAG，RF2识别UAA和UGA。RF与EF在核糖体上的结合部位是同一处，它们重叠的结合部位与防止了EF与F同时结合于核糖体上，而扰乱正常功能。

　　2.终止因子可能还可以使核蛋白体P位点上的肽酰转移酶发生变构，酶的活性从转肽作用改变为水解作用，从而使tRNA所携带的多肽链与tRNA之间的酯键被水解切断，多肽链从核蛋白体及tRNA释放出来。

　　最后，核蛋白体与mRNA分离；同时，在核蛋白体P位上的tRNA和A位上的RF亦行脱落。与mRNA分离的核蛋白体又分离为大小两个亚基，可重新投入另一条肽链的合成过程。核蛋白体分离为大小两个亚基的反应需要起始因子（IF3）的参与。必须指出，上述只是单个核蛋白体的循环，即单个核蛋白体的翻译过程。采用温和的条件小心地从细胞中分离核蛋白体时，可以得到3-4个甚至上百个成串的核蛋白体。称为多核蛋白体，即在一条mRNA链上同一时间内结合着许多个核蛋白体，两个核蛋白体之间有一定的长度间隔，是裸露的mRNA链段，所以多核蛋白体可以在一条mRNA链上同时合成几条多肽链，这就大提高了翻译的效率。在开始合成蛋白质时，一个核蛋白体先附着在mRNA链的起始部位，再沿着mRNA链由5'端向3'端移动，根据mRNA链的信息，有次序的接受携带基酰的各种tRNA，并合成多种肽链。当这一核蛋白体移动到足够远的位置时，另一核蛋白体又可附着此mRNA的起始部位，并开始合成另一条同样的多肽链。每当一个核蛋白体又可到此mRNA的终止密码子时，多肽链即合成完毕，并从核蛋白体及tRNA上释出。同时，此核蛋白体随之从mRNA链上脱落分离为两个亚基，而脱落下来的大小亚基又可重新投入核蛋白体循环的翻译过程。多核蛋白体中的核蛋白体个数，视其所附着的mRNA大小而定。例如，血红蛋白的多肽链约由150个氨基酸残基组成，相应的mRNA的编码区应有450个碱基组成的多核苷酸，长约150nm。网织红细胞核蛋白体的直径为22nm，所以每条mRNA足以容纳好几个核蛋白体。现已证明，网织红细胞多核蛋白体由5-6个核蛋白体串连而成，两个核蛋白体之间的间隔约为3nm。肌球蛋白（即肌凝蛋白）的重链由1800个氨基酸残基组成，相应的mRNA链的编码区应当是5400个核苷酸组成的长链，多核蛋白体由60多个核蛋白体串连而成。