3-2-4 rRNA和核糖体

• 核糖体的组成
• 核糖体的结构
• 核糖体的体外人工重建

　　核糖体（ribosome）亦称核蛋白体，由rRNA和蛋白质组成。单核糖体有二个亚基，分别称为大亚基和小亚基。在原核细胞和真核细胞中核糖体的组成见下表。

原核细胞和真核细胞的核糖体组成

　　核糖体的组成

　　哺乳动物细胞前体rRNA(pre-rRNA)链长45S(1300个核苷酸)。不同哺乳动物细胞来源的rRNA链长有种间差异，大鼠肝28SrRNA和18SrRNA链长分别为4718和1874个核苷酸。5.85rRNA含156个核苷酸，正好与原核细胞的23SrRNA5'端的156个核苷酸序列组成相当。酵母细胞的25S和17SrRNA分别相当于哺乳动物细胞的28S和18SrRNA。5SrRNA为真核和原核细胞共有，含120个核苷酸。原核细胞的16SrRNA和23SrRNA的序列于1978年确定，分别含1542个核苷酸和2904个核苷酸。

　　所有的rRNA均有其基本的特点：

　　(1)rRNA是单链RNA；

　　(2)G-C碱基对与A-U碱基对的总量不等；

　　(3)单股rRNA链可自行折叠，形成螺旋区和环区，所有螺旋区的碱基都是保守的；

　　(4)所有来源rRNA均能形成4个结构域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，每个结构域均含许多茎(螺旋段)和环，它们通过无距离碱基对的相互反应彼此靠近；

　　(5)绝大多数的rRNA碱基的特异功能尚不清楚。据说rRNA中不配对的碱基(环区或单股区)涉及到rRNA与其它RNA的结合，如16S的3'端不配对的碱基与mRNA的起始部位(SD顺序)形成碱基配对。

　　与rRNA或核糖体亚基结合的蛋白质有二类：一类与rRNA或核糖体亚基紧密连接，需高浓度盐和强解离剂(如3mol/LLiCl或4mol/L尿素)才能将其分离，这类蛋白质称为"真"核糖体蛋白质("realribosomalproteins")或简称为核糖体蛋白质。如E.coli30S亚基上的21种蛋白质及50S亚基上的34种蛋白质(共54种，因为小亚基上的S20与大亚基上的L26是相同)；或者在真核细胞40S亚基上的30种蛋白质及60S亚基上的45-50种蛋白质(共约80种)，即属此类。而另一类蛋白质则为与有功能的核糖体亚基疏松缔合，能被0.5mol/L单价阳离子(如K+，NH4+)从亚基上洗脱，并对核糖体循环发挥调节作用的蛋白质，如起始因子(IF或eIF)和延长因子(EF)等，称为核糖体相关蛋白质(proteins associated with ribosome；简称PAR)。PAR不是构成核糖体的固有成分。

　　核糖体的结构

　　自六十年代以来，人们运用化学、物理学和免疫学方法，主要对E.coli核糖体进行了大量的研究，完成了对E.coli核糖体54种蛋白质氨基酸序列及三种rRNA一级和二级结构的测定，初步认识了核糖体颗粒的基本建造(architecture)。这些技术主要包括:

　　(1)电子显微镜术(EM)；

　　(2)免疫学方法；

　　(3)中子衍射技术(neuton scattering)；

　　(4)双功能试剂交联法；

　　(5)不同染料间单态-单态能量转移(singlet-singlet energy transfer)测定；

　　(6)活性核糖体颗粒重建等方法。

　　1.核糖体的颗粒的大小和形状

　　早期的小角X─射线衍射研究和流体动力学测定结果显示，核糖体亚基可能是椭园形。用X线衍射术测定30S亚基的大小为5.5×22×22nm，50S亚基为11.5×23×23nm.其后，用小角中子衍射术和电子显微镜证明50S亚基呈三叶半球形(trilobalhemi spherical model)。RNA和蛋白质的分布相对集中，RNA主要定位于核糖体中央，蛋白质在颗粒外围。

　　电子显微镜是研究核糖体形状和大体结构的最直接方法，在这方面已使用了不同的电子显微镜技术，如常规亮视野透射EM，暗视野EM，扫描透射EM和三维EM。尽管不同的方法存在差异，但有结论认为:小亚基是一扁平不对称颗粒，由头和体组成，分别占小亚基的1/3和2/3。在头和体之间的部分是颈，并有1-2个突起称为叶或平台。不同EM获得的核糖体模式差异主要是:亚基的不对称的程度，突起的数目、大小和形状以及头和体之间部分的深度。

　　大亚基呈半对称性皇冠状(quasi-symmetric"crowm")和对称性肾状。大亚基由半球形主体和三个大小与形状不同的突起组成。中间的突起称为"鼻"，呈杆状；两侧的突起分别称为柄(stalk)和脊(ridge)。柄含二种蛋白质L7/L12，向颗粒外伸出8-12nm。脊含蛋白质L1，故脊又称为L1肩(L1shoulder)。电镜下的70S核糖体大体是圆形颗粒，直径约23nm。小亚基斜(45°角)卧在50S亚基的L1，肩和中心突之间。

　　衍射(diffraction)，如X射线衍射术是确定核糖体精细模型的非常有效的方法。1979-1982年间，已获得了大肠杆菌核糖体亚基的螺旋和二维矩阵，并被用三维映象重构建技术对这些矩阵进行了分析。

　　2.蛋白质的空间排列

　　用免疫电镜法观察到蛋白质位于核糖体的表面。正如前述，在大亚基柄上含L7/L12，其C末端远离50S，而N末端定位在柄的基底部，并与L10相结合(L10与23SrRNA结合)。免疫电镜法也对核糖体的功能域进行了研究，已定位了mRNA、tRNA、抗菌素、起始因子、延长因子及肽酰转移酶的结合部位。抗菌素与起始因子或延长因子能竞争性(或相互拮抗性)地与核糖结合。

　　用双功能试剂进行蛋白质-蛋白质RNA之间交联，已鉴定了许多核糖体蛋白质之间的联系。在分离单个蛋白质的过程中，可获得2种或3种蛋白质形成的复合物，如二聚体(L7/L12)2，或者四个分子聚在一起形成四聚体(L7/L12)4，甚至该四聚体可与L10结合成五聚体(L7/L12)4-L10。亦分离到许多其它蛋白质的复合物，如S13-S19，S3-S4，S3-S5，S3-S5-S10，S4-S5，S4-S20，S5-S8和S5-S10。这些蛋白质交联起来形成复合物，表示有可能在功能上密切相关。

　　3.rRNA的空间排列

　　测定rRNA的空间排列方式的方法主要有电镜法和交联法。其功能部位通过几种方法确定在70S核糖体图中显示了rRNA分子的结合部位和方向。在电镜下，16SrRNA的排列呈V型，一个臂比一个臂稍厚和长。23S的大小和形状可与50S"皇冠"式样很好匹配。有结论认为，rRNA形成了核糖体亚基的骨架，蛋白质与其结合。一般来说，rRNA骨架不发生大的构象改变。用免疫电镜法已确定在亚基内rRNA的某些特征。使用抗N6，6-二甲基腺苷(位于16SrRNA3'末端24和25位)抗体，确定了修饰碱基区段(指16SrRNA3'端约25个碱基)位于30S亚基头和体之间。16SrRNA的第526位的m7G处于30S上1/3和下2/3交界处。16S、5S和23SrRNA的内部交联已被研究。证明在5SrRNA内G41和G72交联，这种交联属三级结构反应，利用此反应已经构建了一处改进的5SrRNA分子三维模型。此外，RNA-蛋白质交联研究也是测定亚基内rRNA分子空间排列的非常有用的方法。

　　现在一般认为，核糖体的基本功能依赖于其中的rRNA，核糖体蛋白质起着加强rRNA功能的作用。核糖体最初由rRNA构建，在进化过程中一些蛋白质加在其上。在体内外的实验均证明了缺乏某些蛋白质的核糖仍有生物活性；此外，rRNA基因(rDNA)突变及甲基化等均可引起对抗菌素(如红霉素、氯霉素)的抵抗。

　　核糖体的体外人工重建

　　核糖体亚基的自我装配(self-assembly)过程于1968年被认识。该过程不需其它任何因子参与，只要把rRNA和相应的蛋白质加入反应系统即可。如加入16SrRNA和21种蛋白质(S1-S21)，即可装配成有天然活性的30S小亚基。核糖体蛋白质与rRNA结合有先后之差，这可能是某一种蛋白质的结合，可诱导核糖体构象改变而暴露出结合位点。

　　1.小亚基的装配。装配有活性的小亚基至少有三个步骤。简言之，大约2/3的30S蛋白质在较低温度条件下现16SrRNA结合，形成一个中间颗粒，沉降系数为21S。当温度上升到37℃后，核糖体中间物经历了一个构象变化，在不增添任何蛋白质的情况下，沉降系数由21S转变为26S。由于构象变化，产生一些新结合位点，其余的蛋白质(占1/3)再次在较低温度条件下与26S颗粒结合，形成完整的和有功能的30S颗粒。图4-41a描述了30S蛋白质与16SrRNA的反应。在实验所用的条件下，从装配图(assmblymap)上可以看出:有7种S蛋白质独自地和直接地与16SrRNA结合。只有这些与rRNA结合的初始蛋白质一级结合以后，其它蛋白质才能结合上去。某些蛋白质如S3、S6、S10、S14、S18和S21甚至属于三级结合，即它们依赖于二级结合完成以后才能最后结合上去。装配图从另一角度亦给予人们关于亚基的拓扑学信息。

　　2.大亚基的装配.与小亚基的装配不同，E.coli大亚基的装配过程需要两种条件孵育，即首先在44℃、4mmol/LMg2+存在条件孵育，装配过程至少需四步，其中产生三个中间颗粒，沉降系数分别为33S、41S和48S。33S颗粒由两种rRNA(23S、5S)和大约2/3的50S蛋白质组成。当温度上升到44℃时，沉降系数从33S增至41S，提示颗粒的构象紧缩。41S与另一些蛋白质结合，转变为48S。把温度上升到50℃，48S转变为有活性的50S大亚基。

　　尽管有约20种蛋白质在反应的第一步与23SrRNA结合，但只有两种蛋白质(L24和L3)能够起始装配过程。在中间物33S颗粒中，20种蛋白质只有5种蛋白质对形成41S颗粒是必需的，其中L20和L24在这步变化中是绝对需要的，但在形成41S颗粒后，将这些蛋白质从41S颗粒中移除，并不影响其后形成的50S亚基的活性，说明这些蛋白质仅仅是一些装配用的蛋白质，而在50S亚基中没有功能。有趣的发现是，在装配的早期，蛋白质与23rRNA的近5'端区段结合；而后期步骤的蛋白质则与其3'端一半区段结合，提示当RNA链正当在合成过程中，装配过程即已开始。

　　50S亚基的装配图也说明，装配过程是逐级进行的。在L20和L15周围至少两个装配的结构域。在L20结构域周围的蛋白质对装配的早期阶段是重要的，而L15周围的蛋白质涉及装配的后期阶段和核糖体的功能。装配图中蛋白质的位置与这些蛋白质的基因在染色体DNA上位置相对应。一个可能的解释是蛋白质复合体是由同一个转录单位编码的，并以复合体形式而不是以单个蛋白质形式参与装配过程，可大大加速装配。通过对核糖体在体外装配的研究，使人们能够进一步认识小亚基蛋白质(S)和大亚基蛋白质(L)的特异功能。

　　现将目前人们对于核糖体的结构功能，以及核糖体与mRNA、tRNA的相互结合位点等的认识概括如下：

　　1.mRNA结合部位和16SrRNA的3'末端定位于30S亚基的平台区。起始因子也结合在此部位。

　　2.两个tRNA结合位点在30S亚基上1/3与平台所形成的裂缝(cleft)处。

　　3.GTPase中心由四分子的L7/L12[(L7/L12)4]组成，位于50S亚基的指状突起即柄上。

　　4.肽酰转移酶中心突(鼻)和脊之间形成的沟中。

　　5.新生肽链的出口正好位于肽酰转移酶的对面，提示在核糖体内30个氨基酸残基的新生肽链贯通其中，而且几乎完全是一个伸展的构象。

　　6.50S亚基与膜结合的部位距肽链出口非常近。

　　7.两个核糖体亚基结合，使得结合mRNA和tRNA的30S平台与含有GTPase和肽酰转移酶活性的50S表面非常靠近。

　　尽管在理解核糖体拓扑学方面取得了这些进展，但已有的研究方法还不能搞清核糖体在原子水平上怎样起作用，象这样的问题最终需依赖X-线衍射技术揭示其详细结构，仅是第一步。