DNA电镜技术及其应用

　　电子显微镜作为一种研究工具在核酸研究中已发挥很大作用并日益受到重视。1859年人们首先发现核酸为活体组织细胞核的主要组成成分，90年后又在电镜下观察到单个核酸分子，而Avery等于1944年发现核酸是遗传的分子基础后，更激起人们了解核酸物理结构的兴趣。1959年Aleinschmedt及Zahn建立了一种新的电镜技术，即细胞色素C展层技术(又称碱性蛋白膜技术及Kleinschmice-Zahn技术)，并成功地在电镜下观察到双链DNA(dsDNA)分子，开始了应用电子显微镜研究DNA结构和功能的新时代［1］。以后经过方法学上的不断改进，又发展了许多新的技术，广泛应用于DNA结构与功能以及蛋白质-DNA相互作用的研究。我们参阅了近三十多年的有关文献并结合本实验室从事核酸电镜技术研究的体会，就DNA电镜的常用技术及其基本应用加以介绍。

　　1　DNA电镜样品制备方法

　　1.1　细胞色素C展层技术(碱性蛋白膜技术)［2，3］　溶液中的DNA分子呈三维无规则超卷曲状态，电镜观察前必须将DNA分子变为二维伸展状态非聚集分子。细胞色素C展层技术的原理就是将DNA溶液与碱性蛋白(细胞色素C)混合，带负电的DNA分子非特异性吸附大量细胞色素C，而后者具有在水或低盐溶液表面变性形成单层膜的特性，这时缠绕其中的DNA分子也随之展开呈二维伸展状态。将变性剂(如甲酰胺等)加入展开液中，可以防止单链DNA分子内碱基非随机配对。细胞色素C展层技术不仅可以用于观察双链DNA分子(dsDNA)，也可用于观察单链DNA分子(ssDNA)，此时该方法也可称甲酰胺展层技术。展开液(上相液)中含0.1～0.5 μg/ml的DNA分子，0.1～0.25 mg/ml的细胞色素C，40%～60%的甲酰胺，缓冲液的pH为8.5。展开液沿斜面流至下相液(蒸馏水或10%甲酰胺，10 mM Tris*HCL, 1mM EDTA pH8.5)上展开，尔后用覆有支持膜的铜网取样。单链DNA分子用此法也能较好地展开，其直径稍细，形态较为曲折。下相液中甲酰胺浓度比上相液中低30%，缓冲液离子浓度为上相液中的10%。

　　1.2　扩散方法［4］　扩散方法是碱性蛋白膜技术的一种变化形式，其原理是碱性蛋白在含DNA的下相液表面形成单层蛋白膜，DNA分子通过扩散运动与蛋白膜接触并吸附其上。该方法可以大大减缓展层过程中的剪切力，尤其适用于较长的DNA分子。其制样过程为：配制混液，将20 ng/ml的DNA，0.2M醋酸胺(pH6.0)，加于小塑料平皿中；将一细针头蘸取细胞色素C粉末轻轻触及下相液表面，静置10～30 min，使DNA扩散并吸附到蛋白膜上，用铜网取样。对此方法进一步简化，建立了一步吸附法。配制DNA及细胞色素C混合液，细胞色素C形成单层膜的同时，DNA分子经过扩散与对流吸附其上，静置4～5 min，铜网取样。DNA的吸附量与其浓度及大小有关，与(时间)3/2成正比。该方法的优点是所用DNA量较少，另外在展开单链DNA时可加入50%甲酰胺。

　　1.3　无蛋白展层技术　细胞色素C(Mr12 000)掩盖了DNA分子的精细结构及其结合的蛋白。Vollenweider等［5］用小相对分子质量的阳离子去垢剂苯二甲基苄基氯化胺(BAC，Mr350)取代细胞色素C，建立了无蛋白展层技术(亦称BAC方法)。制备蛋白质-DNA复合物标本，先用甲酰胺配制2 mg/ml苯二甲基苄基氯化胺的贮存液，将1～2 mg/ml的DNA用缓冲液或展开液稀释50倍，取20 μl在蒸馏水上展开。上述方法对技术条件变化敏感，下相液所用水必须为新蒸馏水或超纯水并经快速预冷。取样时最好用处理过的碳膜。处理方法有辉光放电［6］、溴化乙锭(EB)［7］、多聚赖氨酸(Mr2 000)及Alcian blue等。

　　Thomas［8］用anthrabis取代细胞色素C，也建立了一种地蛋白展层技术，认为对dsDNA、ssDNA及蛋白质-DNA复合体的制样效果优于BAC方法，该方法所用上相液中含有0.1 μg/ml的DNA、0.01%的Anthrabis、30%的甲酰胺及缓冲液(pH8.5)，经扩散方法取样。此外，SDS、EB及二价阳离子等亦曾用于无蛋白制样技术。Griffiths对蛋白质-DNA复合体的电镜研究亦有详细描述［9］。

　　1.4　低温电镜DNA标本的制备　低温电镜(Gryoelectron microscopy)一直被认为是生物电子显微术中最有希望获得生物标本自然结构的手段。其理论基础是基于防止纯水或溶液经快速冷冻后冰晶的形成。水结冰有三种相变形式：常压下-70℃至-130℃形成三角形冰晶，-120℃至-140℃形成立方形冰晶，而-160℃以下形成无定形冰，即玻璃态冰。快速冷冻后DNA样品中的水直接变为玻璃态冰，可以避免因形成冰晶造成结构损伤。在微筛支持膜上制备玻璃态含水的DNA样品，加一套减少电子辐射损伤的电镜技术和相衬成相方法，可以获得高分辨率的近于自然状态的DNA结构图像。该方法也避免了传统电镜制样时脱水、固定、吸附、染色、喷镀等处理对样品结构的破坏。其制样方法为：将3 μl的DNA溶液(200 μg/ml)置于覆有微筛支持膜的铜网上，吸去多余液体，迅速将铜网浸入液氮预冷的液体乙烷中，经低温传输装置转移到冷冻样品台或储存于液氮中。为获得DNA样品的高质量图像，要选择合适的微筛孔径及样品厚度，微筛的制备可用Murray建立的方法。

　　1.5　试剂　细胞色素C和甲酰胺是DNA电镜技术中最重要的试剂。不同型号的细胞色素C展开效果不同，有必要对不同的产品进行预试验，以选择最好的产品。为使DNA电镜图象背景平滑、均匀，可用溴化氰(CNBr)将细胞色素C劈开［10］：将20 mg/ml细胞色素C，用1 ml0.1N HCl及30 mg溴化氰(CNBr)混匀，室温过夜处理，经Sephadex G50层析柱纯化。上相液中甲酰胺的质量对展开效果影响很大，应经纯化［11］或去离子处理［12］。

　　1.6　支持膜［13］　细胞色素C展层技术中常用火棉胶膜，新制备的膜吸附性能及反差效果最好。无蛋白展层技术使用碳膜最好，碳膜较稳定，污染小，但制备较火棉胶膜困难。低温电镜则需特殊的微筛支持膜。

　　1.7　染色及喷镀　重金属染色及小角度旋转喷是增加DNA分子反差的重要手段。染色一般用0.05 M HCl配制的0.05 M醋酸铀溶液，使用时用90%乙醇稀释1 000倍。金属喷镀常用钯铱合金，以7～10℃进行旋转喷镀，可使DNA分子获得足够反差。