实验性变态反应性脑脊髓炎与细胞凋亡

　　摘要： 实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)是研究人类多发性硬化(MS)的 经典动物模型，EAE发 病和愈复过程中细胞凋亡的情况也是目前神经生物学的研究热点。研究者们发现，EAE时CNS 损伤区有自身反应性T淋巴细胞的凋亡，而且这种细胞凋亡促进了EAE的愈复和耐受状态的形 成，这就为EAE乃至人类MS的防治提供了一条新思路。有关EAE其他细胞 凋亡和影响细胞凋亡的因素也有一些研究。本综述对近年来这些方面的研究进展做了较为 全面的回顾。

　　中图分类号:R744.5＋1；R329.2　文献标识码： A

　　文章编号： 1006-2963 （2000）03-175-05

　　实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）是T细 胞介导的中枢神经系统（central nervous system, CNS）脱髓鞘疾病，是人类脱髓鞘疾病 ——多发性硬化 （multiple sclerosis, MS）的经典动物模型。研究EAE的发病及愈复机制 ，对于MS的预防和治疗都有重要意义。有关EAE发病机制的研究近年来有以下进展：（1）介 导EAE发病的淋巴细胞更具体地归类为CD4+Vβ 8.2+T细胞；（2）淋巴细胞产生的细胞 因子如IL-2、IL-4、IL-10、TNF、IFN-γ、TGF-β等，直接参与炎症反应或反应的修 复；（ 3）NO参与EAE的发病，但不同的研究者用不同的动物和诱导方式以及不同的NOS拮抗剂，得 出不同结果［1，2］，因而NO的作用有待进一步明确；（4）Fas/Fas-L系统促进少 突 胶质细胞的损伤，参与EAE的发病［3-6］；（5）细胞凋亡(apoptosis)与EAE发病有 关，尤其在EAE的愈复和免疫耐受形成中起重要作用。

　　细胞凋亡与免疫系统的关系极为密切，淋巴细胞的凋亡涉及到自身免疫性疾病的康复及耐 受机制的形成。对于EAE也不例外。

　　早在60年代中期，就有人发现EAE病程中有细胞死亡，并认为是少突胶质细胞、单核细胞和 淋巴细胞死亡。随着凋亡概念的出现和检测技术的发展，Pender等从形态学上证实EAE中的 细胞死亡以凋亡的形式出现，并认为其中有少突胶质细胞，而后又发现更多的凋亡细胞是T 淋巴细胞，还有一些为巨噬细胞［7］。这些研究成果激起学者们的浓厚兴趣，促进 了对此问题的深入探讨。

　　目前，对凋亡淋巴细胞的进一步分类、影响凋亡的因素以及凋亡的意义等，都有了很多新的 发现。

　　1　EAE中凋亡的细胞

　　1.1　少突胶质细胞　Pender等在证实EAE病程中有细胞凋亡存在的同时发 现：凋亡细胞出现 在CNS的灰质和白质中；白质中的凋亡细胞与正常的有髓纤维毗邻，慢性EAE中则与脱髓鞘的 纤维毗邻；灰质中的凋亡细胞与神经元胞体和髓鞘毗邻；在含有髓鞘碎片、毗邻脱髓鞘轴突 的巨噬细胞中有凋亡的细胞体。前人也曾注意到，Cuprizone中毒小鼠CNS中正在死亡 的少突胶质细胞有明显的染色质边集和核分裂，形成几个大的致密团块。于是，根据凋亡细 胞的大小和位置，Pender等推测凋亡的细胞为少突胶质细胞。但是，对于这种细胞的定性， 却没有更具说服力的证据。曾有人提出不同观点，认为EAE时少突胶质细胞不是凋亡，而是 细胞溶解。用TUNEL技术检测EAE的凋亡细胞，也未检测到呈阳性反应的少突胶质细胞，从而 否定了少突胶质细胞的凋亡［8］。

　　1.2　淋巴细胞　Pender等虽然没有为少突胶质细胞的凋亡提供更多的证据 ，但在提出“EAE 的CNS中可能有特异性淋巴细胞的凋亡”后又进行了一系列的研究。1992年他们使用包埋 前免疫标记技术发现，CNS中10%CD4+细胞和5%αβ T淋巴细胞发生凋亡。而凋亡细胞中， 51%被OX-34标记，38%被R73标记。由此得出结论：急性MBP诱导的EAE,脊髓中的凋亡细胞至 少一半以上是T淋巴细胞，并很有可能是自身反应性的、MBP激活的特异性T淋巴细胞(即MBP -特异性T细胞)。其他研究者也发现，脑损伤区的凋亡细胞64%为T淋巴细胞。1994年他们在 被动转移的EAE模型用流式细胞仪分析细胞表型和DNA，证实了自身反应性T细胞的凋亡 ［9］。该研究发现，Vβ 8.2+T细胞在凋亡细胞中的比例是其在正常T淋巴细胞群中的 7倍，显示出凋亡细胞中Vβ 8.2+细胞的高度聚集，得出“自身反应性Vβ 8.2+T细胞 以凋亡的方式从靶器官中选择性消除”的结论。在主动诱导的EAE也得到类似的结果［1 0］。1995年他们使用有限稀释法分析发现，被动转移的EAE在发病高峰期脊髓中MBP-特 异性淋巴细胞，即Vβ 8.2+T细胞达最高比例（1146个细胞中有1个）；到恢复期，其比 例则奇迹般地降至每105个细胞中1个；同时检测的卵白蛋白(OVA)-特异性T淋巴细胞的比 例 ,在两个时期改变程度较小［11］。这种恢复期Vβ 8.2+T细胞特异性下调的现象 ，进一步证实了前面的观点［9］。1998年，他们检测了介导凋亡的蛋白，发现Vβ 8 .2+细胞中，Fas+和Fas-L+的细胞分别是Vβ 8.2Fas+Vβ 8.2Fas-L +细胞的1.4～5.8倍和1.5～8.8倍，说明Vβ 8.2+细胞表达Fas 和Fas-L的频率高 ［12］，进一步证实了“自身反应性Vβ 8.2+T细胞以凋亡的方式从靶器官中选择 性消除”。其他学者用免疫细胞化学双标技术，在被动转移EAE的SJL/J雌性小鼠也证实了CN S中T淋巴细胞的凋亡［8］。

　　Pender等检测了外周淋巴器官，发现主动诱导的EAE淋巴结中也有凋亡细胞的存在，但数量 较少，主要局限于生发中心，即B细胞区。检测MBP-特异性T淋巴细胞在被动转移EA E的肠系膜淋巴结中的比例同样发现，症状明显时凋亡细胞比例较高，恢复期及恢复后比例 逐渐降低，直至检测不出［11］。MBP-特异性T细胞受体的转基因小鼠胸腺中也有 Vβ 8.2+ T细胞的凋亡［13］。尚未看到关于脾内淋巴细胞凋亡的报道。

　　1.3　巨噬细胞及其他细胞　有研究者发现，一些非淋巴细胞的凋亡细胞， 胞浆丰富，含有 脂滴、空泡和吞噬的髓鞘碎屑，认为是巨噬细胞，并在电镜下得到证实［7］。Bruno Bonetti等采用免疫细胞化学和TUNEL技术，在被动转移EAE急性期的小鼠中观察到环绕血管 周隙的一些小胶质细胞也发生凋亡，但所占比例较低［14］。后来证实，小胶质细 胞比巨噬细胞更易于凋亡［15］。

　　2　EAE中细胞凋亡的机制和影响因素

　　研究者们在确定EAE的CNS中有MBP-特异性淋巴细胞的凋亡后提出细胞凋亡的几种可能机 制：(1)效应性T细胞完成功能后内源性程序引发的自我毁灭过程。但这一机制的可能性不大 ，因为细胞毒T细胞杀靶后可以再循环。(2)对致脑炎性T细胞有特异性定靶作用的 T细胞产 生的细胞毒性（溶细胞性细胞间的相互作用）。(3)内源性皮质醇的释放。这一机制被广泛 认可，并通过肾上腺切除后的EAE大鼠，观察到CNS内T细胞凋亡数量减少［16］而得 到进一步的证实。(4)激活诱导的细胞死亡。后来进一步研究发现，EAE恢复期间和恢复后， 脱髓鞘病变释放的MBP增多，小胶质细胞表达MHC-Ⅱ类抗原也增多，致使新进入CNS的T细胞 被激活，而此时Vβ 8.2+T细胞凋亡比例也升高［12］，为这一机制提供了证据。

　　影响细胞凋亡的因素还很多，其中CNS的内部环境就是一个重要因素，因为研究中发现T淋 巴细胞的凋亡仅限于CNS的实质。CNS的局部因素包括传导信号的失衡,细胞毒因子（TNF-α 、淋巴毒因子）、脑特异性激素和细胞毒T细胞的相互作用。此外，学者们认为脑内的星形 胶质细胞和部分小胶质细胞也能促使T细胞凋亡［14］。至于其机制，可能是由于星 形胶质细胞和部分小胶质细胞属于非专一性抗原递呈细胞，缺乏协同刺激信号所致，属于激 活诱导的凋亡。另外，过量的NO通过诱导型 NOS (iNOS) 在T细胞的凋亡中起重要作用 ［17］。体外研究也证实，活性氧和NO能诱导MBP-特异性T淋巴细胞的凋亡［18］ 。

　　巨噬细胞凋亡的机制及影响因素与淋巴细胞类似［7］，但无Fas/Fas-L的参与 ［15］。现只了解小胶质细胞的凋亡不通过Fas/Fas-L途径［15］（这与有些学者 的观点［8］不太一致），其余无更多的阐述。

　　3　EAE中细胞凋亡的意义

　　很早就有人提出，淋巴细胞的克隆清除可能是EAE愈复和耐受的机制。现已十分肯定，这 种淋巴细胞的“克隆清除”是以凋亡的形式发生的，并有大量研究提供了证据，证实细胞凋 亡在EAE愈复和耐受形成中的作用。

　　研究者联合使用光镜、免疫电镜、免疫细胞化学、原位缺口翻译等技术研究发现，EAE早期 阶段细胞凋亡较少，临床恢复时达到高峰，而此时损伤区中49%的T细胞凋亡了。在被动转移 的EAE，也有类似的发现［9］。这些除了提示人们淋巴细胞的清除与EAE的恢复有关 外，还能解释以往的一些发现:CNS损伤区无髓磷脂-特异性T淋巴细胞的积累；外周血中这 种 特异性淋巴细胞比CNS多；MS患者缓解期外周血中髓磷脂自身免疫性T淋巴细胞的数量与正常 人无明显不同。近年来，用免疫细胞化学和流式细胞分析检测介导凋亡的蛋白，进一步验证 了细胞凋亡与EAE临床恢复的一致性［12］，即Fas+和Fas-L+细胞自发病初期开 始逐渐升高，恢复初期达高峰，而Bcl-2+细胞在整个病程中变化不明显。

　　对于急性EAE,CNS中 T细胞的凋亡与临床愈复的关系基本明确，而与人类MS更为相似的慢性 - 复发性EAE又如何呢？有人在相同条件下，同时检测急性EAE和慢性-复发性EAE病程中细胞 凋 亡的情况，并进行了对比。结果显示慢性-复发性EAE首次发作和再次发作时细胞凋亡情况 与急性EAE类似：发病初期出现凋亡细胞，然后凋亡细胞数量逐渐增加，到恢复初期达高 峰，随后又逐渐减少，几乎减少至零；再次发作时，凋亡细胞又逐渐增加，复发高峰时其数 量也达高峰，然后又再次减少［14］。