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［编者的话］ 近年来，国内外对端粒酶作为肿瘤治疗靶分子的可能性，尤其对测定端粒酶诊断肿瘤的潜在价值，都非常关心。为了满足读者的需要，特在本期发表了这篇有关端粒酶的综述，读者可结合本期简报栏中一组国内研究端粒酶的报道，综观国内外的研究现况。必须指出，虽然端粒酶在肿瘤组织中检出率很高，但由于存在非特异性，要应用于肿瘤的临床诊断还有一段距离，仍需从定性和定量方面进行广泛扎实的观测研究，弄清假阳性的成因，排除各种取标本方式对检测结果的影响，进一步明确与临床的相关性。
端粒是染色体末端的一种特殊结构，在正常人体细胞中，可随着细胞分裂而逐渐缩短。端粒的复制不能由经典的DNA聚合酶催化进行，而是由一种特殊的逆转录酶——端粒酶完成。近年来研究表明，端粒酶活性的表达与细胞衰老和某些疾病，特别是肿瘤的发生、发展都具相关性。能否将酶活性作为肿瘤诊断的指标，以及将端粒酶作为肿瘤治疗的靶点，是当前较受关注的热点之一。
一、端粒及端粒酶
早在30年代，Muller和Meclintock等就已发现了端粒结构的存在。1978年，四膜虫的端粒结构首先被测定，它是由6个核苷酸重复排列的(T2G4)n所组成，且在每条染色体重复次数不等。人的端粒约由15个kb反复串联的TTAGGG结构组成，随着细胞分裂，每代大约丢失50～200 bp。端粒的双链DNA序列位于染色体3′端，并在3′端突出约12～16个G核苷酸，在整个真核生物中都是高度保守的。这些突出的G可通过Hoogsteen型氢键连接形成G-G二聚体，亦可通过C-G典型的Watson-Crick连接及G-G氢键形成C-G*G三联体及更为常见的G4-DNA四联体结构。端粒形成的特殊结构为染色体提供了保护性帽子，使DNA免遭核酸酶及连接酶的破坏，预防DNA损伤后断端染色体的粘连，在染色体定位和复制中起到重要作用。
端粒酶是一种能够催化延长端粒末端的核糖核蛋白（RNP），由RNA和相关蛋白组成。它能够以自身携带的RNA为模板，逆转录合成端粒DNA并添加于染色体末端，从而维持了端粒长度的稳定。四膜虫的RNA组分长为159个核苷酸，其中从第43到51位点为5′-CAACCCCAA-3′的模板，编码1.5个拷贝的端粒序列。人的端粒酶由Morin于1989年在人癌细胞中发现， 其序列在1995年被克隆［1］，其中的RNA组分由450个核苷酸组成，模板RNA为5′-CUAACCCUAAC-3′。目前，Parkinson等［2］已从皮肤鳞状上皮癌细胞中提取出了酶RNA，并将其编码基因定位于3q26.3。
对端粒酶蛋白的研究，近年来报道较多。四膜虫的蛋白组成是最早被测定出来的，包括分子量为80 000和95 000两个亚基，另一种纤毛动物Euplotes则含123 000和43 000两个亚基。交联反应实验证明P95和P123都结合于DNA引物，四膜虫的P80主要与端粒酶RNA相结合，可能是酶具催化活性的结构域。在酵母中，Est1基因的活化可以保持端粒的长度。Steiner等［3］用编码酵母端粒酶RNA的基因TLC1产物与Est1特异性的免疫共沉淀，发现Est1沉淀物中有端粒酶活性，可以延长端粒引物，且只需要三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)和三磷酸脱氧腺苷(dTTP)的存在，提示Est1也有酶催化活性。Nakamura等［4］用纤毛虫P123序列降解引物作酵母的PCR扩增，构建出的端粒酶逆转录酶基因trt1+，可以编码出一个116 000的蛋白，与P123，Est2p相比较，在7个逆转录酶结构域1，2，A，B，C，D，E中都有极为相似的序列。在EST(expressed sequence tag)数据库中可以找到一个与P123/Est2p/Trt1p相同源的人的基因编码产物hTRT，被认为可能是人的端粒酶催化亚单位。事实上，也已有文献证明哺乳动物有与四膜虫P80同源的TP1存在［5］。
对于活化端粒酶，有很多维持端粒长度因素的假说。Harley等［6］认为正常人细胞端粒缩短到一定程度时即进入第一死亡期M1，一些细胞由于基因突变可能逃逸M1期，进入第二死亡期M2期。这时端粒酶仍为阴性，端粒仍进一步缩短，大部分细胞死亡。生存下来的细胞逃逸M2期，获得无限增殖能力，端粒酶呈阳性，成为永生化细胞。在这个过程中，癌基因和抑癌基因起到了不容忽视的作用。在人的纤维母细胞中，至少有3个转录调节因子c-fos，Id和E2F在老化的细胞中受抑制。其中E2F的受抑制很可能是P21和P16 的过度表达，抑制了细胞周期蛋白激酶(CDKs)的活性，从而导致了PRb蛋白磷酸化水平的降低［7］。Shay 等［8］使用DNA肿瘤病毒癌基因人乳头状瘤病毒(HPV)E6和E7做转基因实验，证实了从M1期逃逸需要P53和PRb的共同作用。
另一些实验表明，端粒酶的活性与细胞周期、有丝分裂具一定相关性。Zhu等［9］观察到，当细胞被阻于G1/S期，端粒酶活性与非同步化细胞中酶活性相似；重新进入细胞周期后，活性升高；阻于S期时，酶活性最高；而阻于G2/M期的细胞几乎没有酶活性；进入G0期的细胞，其端粒酶的活性几乎不受影响。人体内Pin2基因编码产物可以影响到曲霉菌的NIMA(never-in-mitosis A)蛋白激酶的活性［10］。Pin2直接与端粒DNA结合，在表达端粒酶活性的细胞中，仅高度集中于极少量的端粒处。在Hela细胞周期中，G2＋M期表达增高，G1期表达下降，这与Zhu观察到的相反，提示Pin2抑制酶活性，同时两者都与细胞周期的调控相关。
二、临床意义及检测方法
已知85％的人肿瘤组织中已发现了端粒酶活性的表达，而与肿瘤相邻的正常组织或良性病变仅为4％左右。因此，把端粒酶作为肿瘤基因诊断的指标和基因治疗的新靶点将是很有可能的。在Kim等［11］所测的100个永生化细胞系中，94个肿瘤衍生的细胞株端粒酶阳性，6个癌病毒转化的细胞株，有4个大T抗原转化的细胞株端粒酶表达阳性，而其他22种正常组织和50种良性肿瘤组织表达均为阴性。Kavaler等［12］在104例未治疗的膀胱肿瘤中发现，88％的肿瘤组织呈端粒酶阳性，其中79％的一期肿瘤，84％的二期肿瘤和87.5%三期肿瘤呈阳性，5例原位癌也均呈阳性。但在膀胱结石，良性尿道狭窄，良性前列腺增生和炎症组织中端粒酶呈现阴性，35例正常标本也均呈阴性。对于恶性嗜铬细胞瘤的检测也发现，在16例良性瘤组织中端粒酶表达均为阴性，而在3例恶性瘤组织中端粒酶活性分别达87.6，71.2，180.3个单位［13］，这对过去诊断困难的恶性嗜铬细胞瘤提供了一个新的思路。在诸多其他肿瘤中同样有很高的端粒酶活性表达，常见的如肝癌(86%)，小细胞肺癌(100%)，非小细胞肺癌(78%)，胰腺癌(95%)，卵巢癌(91%)，膀胱肿瘤(92%)，黑色素瘤(86%)。当然，什么情况下出现假阳性，如何鉴别排除，端粒酶检测的取样标本及其与临床诊断的相关性，还有待进一步扩大研究。
端粒酶活性的高低与肿瘤分化的程度也具相关性。Murakami等［14］的实验指出，在25例恶性卵巢肿瘤中92％呈端粒酶阳性，同时在分化差的恶性肿瘤中酶活性明显高于其他肿瘤。Nakatani等［15］在对脑肿瘤细胞测定中指出，测到酶活性的星形胶质细胞瘤的恶性度明显高于测不到酶活性的星型胶质细胞瘤，认为端粒酶的活性可能是检测多形性胶质细胞瘤恶性程度的一个全新标志。
除了端粒酶本身，有人证实酶组分RNA(human Telomere RNA， hTR)水平与肿瘤的发生有相关性。Soder等［16］用原位杂交的方法测定了300多份肿瘤样本，发现不同肿瘤样本的hTR表达各不相同；26%的非小细胞肺癌，41%的肺鳞癌表达可测的hTR，而肺腺癌和大细胞癌则很少表达。在其他如乳腺癌，卵巢腺癌也有低频hTR表达。在43%表达hTR的宫颈癌中，鳞癌及腺癌表达水平没有显著差异。正常的睾丸生殖细胞可表达一定的hTR，恶性睾丸生殖细胞中有73%表达，而分化的卵巢生殖细胞肿瘤和睾丸畸胎瘤则缺乏hTR的表达。
检测端粒酶的活性，最初采用同位素标记核苷酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳间接检测组织提取物中的酶活性。
1994年经改进的端粒重复序列扩增法(TRAP)［11］，原理是将PCR扩增端粒反应的3′-末端引物，在端粒酶的催化下延伸，增加TTAGGG重复序列，再将这种端粒酶反应产物进行PCR扩增，故表达量提高了104倍。用银染色法，荧光标记，生物素标记，酶联免疫吸附法(ELISA)就可检测，不用放射性同位素显示，同样有较好的效果。
三、端粒酶与基因治疗的可能途径
由于对端粒酶结构研究尚不完善，目前对于聚合酶活性位点及锚定位点的抑制研究还很少，但对于酶RNA逆转录复制抑制剂和模板RNA抑制的研究已趋向深入。使用AZT与 Hela肿瘤细胞共培养传代至第15代，用生物素标记人的探针与端粒序列杂交，发现端粒进行性缩短，除去AZT后，端粒在25代之内都没再增长，也没有衰老现象发生［17］。Fletcher等［18］则使用无细胞生化端粒酶分析，发现7-deaza-dGTP和7-deaza-dATP都是可能的端粒酶抑制剂。半数抑制浓度(IC50)对7-deaza-dATP为11 μmol/L，对7-deaza-dATP为8 μmol/L，二者都由端粒酶介导参入DNA。因此可同时用来研究端粒DNA二级结构对酶活性的影响。
此外，Feng等［1］还用反义hTR抑制恶性肿瘤，并可因此导致肿瘤细胞的死亡。Hamilton等［19］通过使用肽核苷酸(PNAs)结合于RNA活性位点，认为C50-C52及C56是PNA识别并被抑制剂结合的位点。
端粒酶作为肿瘤治疗的新靶点，目前已逐渐被重视起来。但是，研究过程中也出现了一些有待解决的问题。在一些肿瘤细胞株中没有酶活性的表达，提示可能有非端粒酶介导的端粒长度控制途径，在临床监测中可能出现假阴性。另外，不同的瘤组织对不同的检测手段敏感性不同，只有我们对不同肿瘤的特性有了更充分的认识，才可找到更为专一、敏感、可靠的检测方法。无论如何，一旦上述的矛盾问题得以解决，肿瘤的临床监测与治疗将会取得突破性进展。不仅如此，目前尚有研究证明端粒酶与其他一些疾病，包括艾滋病都有一定相关性［20］。可以预见，随着研究的深入，端粒酶将为多种疾病的诊断与治疗提供快捷，特异，副作用小的检测新途径。
作者单位：张骏(100083 北京医科大学基础医学系)，王新娟(生化和分子生物学系)
参考文献
1 Feng J, Fuck WD, Wang SS, et al. The RNA component of human telomerase. Science, 1995,269：1236-1241.
2 Parkinson EK, Newbold RF, Keith WN. The genetic basis of human keratinayte immortalisation in squamous cell carcinoma development: the role of telomerase reactivation. Eur J Cancer, 1997, 33:727-734.
3 Steiner BR, Hidaka K, Futcher B. Association of the Est1 protein with telomerase activity in yeast. Proc Nati Acad Sci USA, 1996, 93:2817-2821.
4 Nakamura TM, Morin GB, Chapman KB, et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science, 1997, 277:955-959.
5 Harrington L, McPhail T, Mar V, et al. A mammalian telomerase-associated protein. Science, 1997, 275：973-977.
6 Harley CB, Futcher AB, Grider CW. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature, 1990, 345:458-460.
7 Campisi J. The biology of replicative senescence. Eur J Cancer, 1997, 33:703-709.
8 Shay JW, Wright WE, Brasiskyte D, et al. E6 of human papillomavirus type-16 can overcome the M1 stage immortalization in human mammary epithelial cells but not in human fibroblasts. Oncogene, 1993, 8:1407- 1413.
9 Zhu XL, Kumar R, Mandal M, et al. Cell cycle-dependent modulation of telomerase activity in tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:6091-6095.
10 Shen M, Haggblom C, Vogt M, et al. Characterization and cell cycle regulation of the related human telomeric proteins Pin2 and TRF1 suggest a role in mitosis. Proc Natl Acad Sci USA , 1997, 94:13618-13623.
11 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, 266:2011-2015.
12 Kavaler E, Landman J, Chang Y, et al. Detecting human bladder carcinoma cells in voided urine samples by assaying for the presence of telomerase activity. Cancer, 1998, 82:708-714.
13 Kubota Y,Nakada T, Sasagawa I, et al. Elevated levels of telomerase activity in malignant pheochromocytoma. Cancer, 1998, 82:176-179.
14 Murakami J, Nagai N, Ohama K, et al. Telomerase activity in ovarian tumors. Cancer, 1997, 80:1085-1086.
15 Nakatani K, Toshimi N, Mori H, et al. The significant role of telomerase activity in human brain tumors. Cancer, 1997, 80:471-472.
16 Soder AI, Going JJ, Kaye SB, et al. Tumor specific regulation of telomerase RNA gene expression visulized by in situ hybridization. Oncogene, 1998, 16:979-983.
17 Gomez DE, Tejera AM, Olivero OA, et al. Irreversible telomere shortening by 3′-azido-2′,3′-dideoxythymidine(AZT) treatment. Biochem Biophys Res Commun, 1998, 246:107-110.
18 Fletcher TM, Salazar M, Chen SF, et al. Human telomerase inhibition by 7-deaza-2′-deoxypurine nucleoside triphosphates. Biochemistry, 1996, 35:15611-15617.
19 Hamilton SE, Pitta AE, Katipally RR, et al. Identification of determinants for inhibitor binding within the RNA active site of human telomerase using PNA scanning. Biochemistry, 1997, 36:11873-13880.
20 Effros RB. Shortened telomeres in the expended cd28-cd8+ cell subset in HIV disease implicate replicative senescence in HIV pathogenesis. AIDS, 1996, 10:17-18.