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孕妇外周血胎儿细胞的富集技术及其在产前诊断中的应用

来源:论文汇编
摘要:羊膜穿刺和绒毛吸取是目前常用的产前诊断技术,但其操作具有创伤性,可导致宫内感染、羊膜破裂、流产、胎儿畸形或死亡等[1]。自50年代从孕妇外周血中发现胎儿细胞后,学者们开始关注这类细胞在产前诊断中的应用价值,但因技术条件的限制,这一非创伤性诊断方法进展缓慢。直至80年代中期,随着胎儿细胞分离技术的日趋成......

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  羊膜穿刺和绒毛吸取是目前常用的产前诊断技术,但其操作具有创伤性,可导致宫内感染、羊膜破裂、流产、胎儿畸形或死亡等[1]。建立非创伤性产前诊断方法,降低产前诊断的风险,是产前诊断工作的一项重大课题。自50年代从孕妇外周血中发现胎儿细胞后,学者们开始关注这类细胞在产前诊断中的应用价值,但因技术条件的限制,这一非创伤性诊断方法进展缓慢。直至80年代中期,随着胎儿细胞分离技术的日趋成熟和分子生物学、细胞遗传学诊断技术的迅猛发展,这一产前诊断方法才有了新的突破,并成为近十年来众多学者研究的热点,现综述如下。

  1 胎儿细胞的特征和消长规律

  1.1 类型

  目前从孕妇外周血分离到的胎儿细胞有滋养叶细胞、淋巴细胞和有核红细胞(NRBC)。因滋养叶细胞体积大、容易在肺组织滞留;淋巴细胞出现晚,存活时间长(半年~27年),在下次妊娠时妇女血液中可再次出现[2],其应用价值不大。

  NRBC是用于产前诊断最理想的胎儿细胞,它有如下特征:(1)可在妊娠早期出现,寿命短(不超过90天),便于早期诊断[3];(2)可表达出特殊的抗原成分,便于富集;(3)可发生特殊的血红蛋白反应,便于鉴定[4];(4)携带胎儿全部基因组,便于遗传学和分子生物学分析。

  1.2 抗原性

  胎儿细胞的抗原性是鉴定、富集胎儿细胞的生物学基础,现已证实,胎儿NRBC有4种特殊的抗原成分:转铁蛋白受体(CD71)、凝血酶敏感蛋白受体(CD36)、糖蛋白A(GPA)和红细胞膜蛋白[5-7]。最近Steele等[8]又从孕妇外周血中发现HLA-G mRNA基因信号,提示HLA-G很可能是胎儿NRBC的另一抗原标志。

  1.3 消长规律

  探讨胎儿细胞的消长规律有助于选择产前诊断的最佳时间。Tomas等[9]发现人工受精的妇女血液检出Y染色体特异性序列的时间为4周零5天,最迟50天,首次检出的平均时间为6周±4天,消失时间为产后2个月。Simpson等[10]研究发现,从孕妇外周血分离胎儿NRBC的最佳时间为妊娠后10~18周。马旭等[11]发现19例妊娠男胎妇女外周血Y染色体锌指蛋白基因(ZFY)在妊娠6周、11周、14周时的检出率分别为5.3%、68.4%和95.0%,同时还发现妊娠女胎的妇女外周血无1例ZFY假阳性,提示分离胎儿NRBC进行产前诊断的最佳时间为妊娠14周。

  1.4 含量

  胎儿NRBC含量高低关系到产前诊断的准确性。众多的研究表明,胎儿细胞与母体在细胞之比为1∶5000~1∶20 000,其中胎儿NRBC的比例在1∶105~1∶109之间。从理论上,只要有理想的富集、分析方法,胎儿NRBC含量完全可以满足诊断需要。

  2 胎儿细胞的富集

  纯度和产量是衡量胎儿细胞富集效力的两个重要概念,纯度是指分离后样本内胎母细胞百分比,产量是指实际获得的胎儿细胞数,不同方法对富集胎儿细胞的纯度和产量有很大影响,现就现有的富集方法分述如下。

  2.1 密度梯度离心法

  利用聚蔗糖与泛影酸钠混合物作分离介质,加至孕妇血中离心,根据细胞密度的差异分离出胎儿细胞。该法简便易行,但胎儿细胞的纯度和产量不高。宋杰等[12]用此法分离胎儿细胞预测胎儿性别的灵敏度和特异度分别为84.85%和96.77%,总符合率为90.63%。

  2.2 γ珠蛋白阳性选择法

  胎儿血红蛋白主要为HbF,而成人为HbA。HbF由两条α珠蛋白和两条γ珠蛋白链组成;HbA由两条α珠蛋白和两条β珠蛋白链组成。利用抗γ珠蛋白的单克隆抗体通过流式细胞计数仪可富集胎儿NRBC。Zheng等[3]证实83%~100%抗γ珠蛋白阳性细胞为孕妇血液中的胎儿细胞。

  2.3 荧光激活细胞分类法

  又称流式细胞计数仪分离法。先制备单核细胞悬液,用荧光素激活胎儿NRBC,利用流式细胞计数仪将胎儿NRBC从孕妇血液中分 离出来。Bianchi等[5]用荧光素标记抗CD71、CD36、GPA抗体后分离胎儿NRBC,再用PCR进行Y染色体序列分析,发现单独用抗CD71、CD36富集胎儿NRBC诊断胎儿性别的准确度分别为57%和88%,而单独用抗GPA或同时使用抗CD71、CD36富集胎儿NRBC诊断胎儿性别的准确度为100%。Wachtel等[14]和国内学者李智等[15]研究也有相似的结论。提示使用的抗体不同对分离胎儿细胞的纯度和产量有很大影响。

  2.4 磁性激活细胞分类法

  利用磁珠吸附胎儿NRBC,在磁场作用下将胎儿NRBC从孕妇血液中分离出来,包括以下两种方法。

  2.4.1 磁场正相富集 又称磁场阳性富集。孕妇血液经密度梯度离心制备单细胞悬液,加入磁珠标记的单克隆抗体与胎儿NRBC结合,在磁场作用下阳性吸附NRBC,洗涤并振荡后获取胎儿NRBC。该法简便易行,但富集胎儿NRBC的含量和纯度不高。

  2.4.2 磁场双相富集 孕妇血单细胞悬液中加入CD14和CD45单克隆抗体,使之与淋巴细胞和非红细胞单核细胞结合,再加入磁珠标记的羊抗鼠IgG,在磁场作用下吸附并去除淋巴细胞和非红细胞单核细胞(反相富集或阴性选择);剩余物中加入CD71单克隆抗体,使之与胎儿NRBC反应,再次加入磁珠标记的羊抗鼠IgG,在磁场作用下吸附胎儿NRBC(正相富集或阳性选择),洗涤振荡,获取胎儿NRBC。该法虽操作复杂,但获取的胎儿NRBC产量和纯度很高。Steel等[8]运用该技术可从18ml孕妇血液中获取3×104个胎儿NRBC,胎母细胞比在1∶3000~4∶3000之间。

  3 临床应用

  现已从基因和染色体水平对孕妇外周血胎儿细胞作产前诊断。在基因水平主要是用PCR鉴别胎儿性别、研究胎儿β-地中海贫血、Rh血型和HLA多态性。在染色体水平主要是用荧光原位杂交(FISH)诊断21三体、18三体、Klinefelter综合征和47,XXY等染色体病。

  3.1 预测胎儿性别

  用孕妇外周血胎儿细胞Y染色体PCR分析预测胎儿性别始于1989年[16]。4年后,Lo等[17]又报道了用妊娠早、中期原血作Y染色体序列分析的结果,发现7例男胎有6例预测正确,6例女胎有5例预测正确,只要300 000个母体细胞中含有1个胎儿细胞,就能成功地预测胎儿性别。现已证实,胎儿NRBC经GPA抗体吸附磁场分离后,PCR预测胎儿性别的准确度和特异度可达100%[5]。目前国内的研究和应用也日趋成熟,已有许多成功的先例[12,18],接近国际先进水平。

  3.2 预测Rh血型

  多数情况下,Rh(D)阴性源于1号染色体Rh(D)基因缺失,若从Rh阴性血液中检出Rh(D)基因,则提示胎儿Rh血型阳性。Lo等[19]用妊娠晚期母体原血预测胎儿Rh血型取得成功。最近Geifman-Holtzman等[20]发现,妊娠早期母体血液富集胎儿NRBC后,用PCR预测Rh血型的特异度和敏感度分别为100%和84%,运用该法判断Rh(D)血型时常会出现血清学与PCR结果不符的问题。一方面,无Rh(D)抗原表达的人仍可能持部分Rh(D)基因片段,若扩增选在该区域内,会出现假阳性结果;另一方面,有人虽能表达Rh(D)抗原,但当扩增区域位于缺少的外显子内或样品不含胎儿细胞时,则出现假阴性结果。

  3.3 诊断单基因遗传病

  1990年Camaschells等[21]最早用孕妇外周血诊断胎儿β-地中海贫血/Hb Lepor病获得成功。他们对3例高危孕妇在妊娠8~10周的血液进行11号染色体Lepore突变基因PCR分析,发现2例预测正确,第3例孕妇血液Lepore基因阴性,其丈夫携带正常的Hb基因。从理论上讲,只要能够建立有效的胎儿细胞富集技术和PCR检测手段,许多单基因病的非创伤性产前诊断都能迎刃而解。

  3.4 诊断染色体病

  1991年Price等[22]首次用胎儿细胞诊断出1例18三体妊娠。作者用妊娠10周孕妇血液分离胎儿NRBC,用X、Y和18号染色体专一性探针作FISH,发现胎儿NRBC大部分出现以上3种染色体杂交信号,后经绒毛活检证实诊断正确。作者又用同样的方法诊断出1例21三体妊娠。Elias等[23]用CD71 GPA单克隆抗体磁场富集胎儿NRBC,用X、Y、18和21号染色体专一性探针作FISH,共研究了69名孕妇外周血,8例非整倍体妊娠只有1例未被检出,而且无1例假阳性。有人用同样方法诊断出13三体综合征[8]。

  从孕妇外周血分离胎儿细胞进行产前诊断已取得了重要进展,但其临床应用中的问题仍需要进一步的研究,如富集胎儿细胞的最佳时间,影响因素,建立特异而敏感的基因、染色体分析方法,克服假阴性、假阳性问题等。只有解决好这些问题,这种方法才能成为理想的非创伤性产前诊断方法。

  作者单位:272000 山东省济宁市妇女儿童医院(王连福、陈西贵);

  济宁市临床检验中心(高仙峰)

  参考文献

  [1]王淑贞主编.妇产科理论与实践.上海:上海科学技术出版社,1993.320.

  [2]Bianchi DW, Zickwolf GK, Weil GJ, et al.Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996,93(6)∶705-708.

  [3]Pearson HA. Life-span of the fetal red blood cell. J Pediatr, 1967,70(2)∶166-171.

  [4]Simpson JL, Lewis DE, Bischoff FZ, et al.Isolating fetal nucleated red blood cells from maternal blood:the Baylor experience. Prenat Diagn, 1995,15(8)∶907-912.

  [5]Bianchi DW, Zickwolf GK, Yih MC, et al. Erythroid-specific antibodies enhance detection of fetal nucleated erythrocytes in maternal blood. Prenat Diagn, 1993,13(4)∶293-300.

  [6]马旭,张思仲,赵丽.孕妇外周血中转铁蛋白受体阳性细胞来源的初步分析.中华血液学杂志,1996,17(5)∶286-288.

  [7]马旭,张思仲,赵丽,等.孕妇血中胎儿细胞性质和来源的研究.中华医学杂志,1995,75(1)∶31-33.

  [8]Steele CD, Wapner RJ, Smith JB, et al.Prenatal diagnosis using fetal cells isolated from maternal peripheral blood:a review. Clin Obstet Gynecol, 1996,39(4)∶801-813.

  [9]刘丽泽.胎儿DNA在母体循环中出现和消失的时间.国外医学妇产科学分册,1996,23(3)∶176.

  [10]Simpson JL, Elias S. Isolating fetal cells from maternal blood.Advances in prenatal diagnosis through molecular technology. JAMA,1993,270(19)∶2357-2361.

  [11]马旭,王毅,王琳,等.经母血采集胎儿细胞行产前诊断的最佳时间探讨.中华妇产科杂志1997,32(5)∶293-295.

  [12]宋杰,李守柔,张爱臣,等.富集孕妇外周血中胎儿细胞行性别诊断.中华妇产科杂志,1998,33(1)∶74-76.

  [13]Zheng YL, Carter NP, Price CM, et al.Prenatal diagnosis from maternal blood:simulataneous immuophnotyping and FISH of fetal nucleated erythrocyte isolated by negative magnetic cell sortion.J Med Genet, 1993,30(12)∶1051-1056.

  [14]Wachtel S, Elias S, Price J, et al.Fetal cells in the maternal circulation:isolation by multiparameter flow cytometry and confirmation by polymerase chain reaction. Hum Reprod, 1991,6(10)∶1466-1469.

  [15]李智,夏铁安.孕妇外周血胎儿有核红细胞的分离与检测.中华医学遗传学杂志,1998,15(2)∶111-114.

  [16]Lo YMD, Patel P, Wainscoat JS, et al.Prenatal sex determination by DNA amplification from maternal peripheral blood. Lancet, 1989,2(8676)∶1363-1365.

  [17]Lo YMD, Patel P, Baiget CN, et al.Prenatal sex determination from maternal peripheral blood using polymerase chain reaction. Hum Genet, 1993,90(5)∶483-488.

  [18]马旭,张思仲,罗安雪,等.利用孕妇血中胎儿细胞进行产前诊断的初步研究:胎儿SRY基因的鉴定.中华医学遗传学杂志,1995,12(5)∶265-269.

  [19]Lo YMD, Bowell PJ, Selinger M, et al.Prenatal determination of fetal Rhesus D status by DNA amplification of peripheral blood of Rhesus-negative mothers. Ann N Y Acad Sci, 1994,731(2)∶239-241.

  [20]Geifman-Holtzman O, Bernstein IM, Berry SM, et al.Fetal RhD genotyping in fetal cells flow sorted from maternal blood. Am J Obstet Gynecol, 1996,174(7)∶818-822.

  [21]Camaschella C, Alfarano A,Gottardi E, et al.Prenatal diagnosis of fetal hemoglobin Lepore-Boston disease on maternal peripheral blood.Blood, 1990,75(6)∶2102-2106.

  [22]Price JO, Elias S, Wachtel SS, et al.Prenatal diagnosis with fetal cells isolation from maternal blood by multiparameter flow cytometry. Am J Obstet Gynecol, 1991,165(6)∶1731-1737.

  [23]Elias S, Price J, Dockter M, et al.First trimester prenatal diagnosis of trisomy 21 in fetal cells from maternal blood. Lancet, 1992,340(8826)∶1033.

作者: 自动采集 2005-1-1
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