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Alzheimer 病的T淋巴细胞功能活性检测
中国神经免疫学和神经病学杂志 1999年第4期第6卷 论 著
作者：韩杰 钱采韵 林宏川 马秋兰 俞纯山 孔庆瑜
单位：中山医科大学附属第一医院神经科， 广州 510089
关键词: Alzheimer病；T淋巴细胞亚群；增殖功能；细胞因子
摘要 目的 探讨外周T淋巴细胞功能活性与Alzheimer病(AD)病情的关系。方法 流式细胞仪测定T细胞亚群；MTT法检测ConA刺激AD外周淋巴细胞的增殖功能；ELISA法检测细胞因子及其受体表达。结果 (1) CD4+、CD8+T细胞比例和CD4+/CD8+比值各组间无统计学差异。(2) 淋巴细胞增值在轻、重AD组略下降，但刺激指数(SI)都大于2，与对照无明显差异。(3) IL-2的分泌在重度AD组和sIL-2R表达在轻、重度AD组明显升高(P＜0.05)，IL-2R的表达各组间差异无显著性。结论 T淋巴细胞亚群变化与AD病情的联系不明显，细胞因子分泌功能与AD进展有关。
中图号 R749.1
Immune-associated Function and Activity of T Lymphocyte in Alzheimer Disease
Han Jie Qian Caiyun Lin Hongchuan Ma Qiulan Yu Chunshan
（Department of Neurology, The First Affiliated Hospital, Sun Yatsen University of Medical Science, Guangzhuo 510089）
Objective To investigate the relationship between the immune-associated function and activity of T lymphocyte and severity of Alzheimer′s disease stage.Methods The patients were divided into two groups-mild and moderately severe-according to severity of disease stage, and their lymphocytes were compated to those of elderly controls. Monoclonal antibodies labeled by FITC were used to lymphocyte subset analysis. Lymphocytes were stimulation with ConA, we observed the proliferative ability, IL-2 secretion, cell membranal IL-2R expression and sIL-2R expression.Results 1. No significant differences were found in T lymphocyte subpopulations and the ratios of CD4/CD8 between groups (P＞0.05). 2. All groups revealed strong response to ConA, there were no significant differences between AD and controls (P＞0.05). 3. The IL-2 levels showed increase in AD groups and there was significant differences between moderately severe AD and controls (P＜0.05).The amount of sIL-2R revealed an increase in AD groups, there were significant differences between AD and controls (P＜0.05). The expression of IL-2R revealed no significant differences between AD and controls(P＞0.05).Conclusions Our results indicated that immunologic parameters may be useful in monitoring progression of AD.
Key words Alzheimer disease; T lymphocyte subset; proliferative ability; cytokines
目前Alzheimer病(AD)的发病机制尚不清楚，近年来与免疫功能异常的关系引起关注。研究发现在老年斑周围有大量的人类白细胞抗原(HLA-DR)和IL-2受体阳性细胞存在，以及CD4+、CD8+ T淋巴细胞存在于海马和颞叶中［1］。但外周免疫功能指标与脑内的免疫反应的关系，以及应用于AD病情评价报道不一［2～5］。本研究对外周T淋巴细胞功能活性与AD病情关系进行了探讨。
1 对象和方法
1.1 对象 研究对象来自广州市老人院。(1) AD痴呆组：采用简易精神状态检查法(MMSE)量表进行痴呆筛选，依据ADRDA-NINCDS的临床诊断“可能性AD”的诊断标准，共获得38例晚发性AD患者，13例男性、25例女性［平均年龄(80.7±1.9)岁］，病程(4.8±3.4)年。按MMSE评分和根据临床痴呆评估(CDR)标准，分为轻度痴呆20例和重度痴呆18例。(2) 非痴呆老人对照组：采用MMSE量表对能够自理生活的住院老年人进行记忆、智能测定，共选择20例作为对照。所有研究对象均通过询问既往疾病史和查阅体检化验记录，进行常规和神经系统体检，排除患有与免疫有关的疾病和服用影响免疫功能药物的老人；抽血前2周内无明确感染史。
1.2 方法
1.2.1 外周单核细胞(MNC)分离：常规分离外周血MNC，用RPMI 1640完全培养液［含10%(体积分数)小牛血清］，调整细胞浓度为2×106/mL备用。
1.2.2 T淋巴细胞亚群测定：分别取1×105细胞，用FICT标记单抗(Sigma)直接标记，流式细胞仪(美国EPICS ELITE)测定CD4+、CD8+T细胞亚群的比例(%)。
1.2.3 淋巴细胞增殖功能的测定：
(1) MTT法测定淋巴细胞增殖功能：参照Mosmann法，取外周血MNC细胞悬液1mL于24孔培养板，一式2份，一孔不加刺激物为对照孔，另一孔加入ConA 5 μg/mL (Sigma) 为实验孔；置入37℃、5%(体积分数)CO2培养箱中；培养44 h后，吸出上清液700 μL(置入-80℃冰箱中，备测IL-2、sIL-2R)，加入MTT50 μL (Sigma)和不含小牛血清的RPMI 1640液700 μL， 置入培养箱培养4 h后取出。加入1.2 mL的酸性异丙醇，吹打混匀终止反应。用722光栅分光光度仪570 nm读取吸光度(A)，以实验孔A(As)减对照孔A(Ac)得ΔA，计算刺激指数(stimulation index, SI=ΔA/Ac×100%)进行比较。
(2) IL-2R(CD25)测定：取MNC细胞悬液0.3 mL加入24孔培养板内，加入ConA 5 μg/mL置入37℃、 5%(体积分数)CO2培养箱中，培养48 h后用FITC抗CD25单抗(Sigma)标记，流式细胞仪测CD25表达。
(3) IL-2、sIL-2R测定：取外周血MNC细胞培养上清液，用ELISA法测定，具体步骤按说明书进行(Genzyme公司试剂盒)；最后用全自动酶标仪(美国Dynatech Mrx) 450 nm测定数据。
1.3 统计处理 采用SPSS统计软件包进行均数t检验和ANOVA检验。
2 结果
2.1 患者的一般特征 对照组、轻度AD和重度AD组的性别、年龄构成和MMSE结果如表1所示。AD组的性别构成、年龄与对照组基本一致。AD组白蛋白含量较对照组明显降低(P＜0.05)，然而两组的含量均在正常范围之内(35～55 g/dL)。
表1 患者的一般特征
Table 1 Patient characteristics(
| Control | Mild AD | Moderately severe AD | |
| Number | 20 | 20 | 18 |
| Gender(M/F) | 7/13 | 8/12 | 5/13 |
| Age(year) | 80.7±2.7 | 79.6±2.1 | 80.9±1.7 |
| MMSE | 26.8±1.2 | 15.0±0.8 | 2.9±0.8 |
| Serum albumin(g/dL) | 44.9±0.7 | 39.4±1.5* | 37.1±1.0* |
*t test vs controls, P＜0.05
2.2 各组外周血淋巴细胞亚群检测结果 如表2所示：CD4+、CD8+T细胞在轻度AD中略下降，在重度AD组中均升高，但与对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)。各组CD4+/CD8+比值均在正常值范围(1.5～2.0)。
表2 各组外周血淋巴细胞亚群检测结果
Table 2 T lymphocyte subset analysis in AD patients(
| Control | Mild AD | Moderately severe AD | |
| CD4+ | 41.3±0.9 | 40.9±1.6 | 44.4±1.6 |
| CD8+ | 24.8±0.6 | 22.8±0.8 | 27.3±1.5 |
| CD4+/CD8+ | 1.7±0.1 | 1.9±0.1 | 1.7±0.1 |
2.3 ConA刺激下各组的淋巴细胞功能检测结果 如表3所示：各组对ConA的刺激都有明显的增殖：轻、重度AD组略呈下降，但SI都大于2，与对照组比较差异不明显(P＞0.05)。IL-2R的表达各组间差异无显著性(P＞0.05)。IL-2的分泌于轻度AD略升高；重度AD组升高明显，与对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。sIL-2R表达轻重度AD组均明显升高，与对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。
表 3 ConA刺激下各组的淋巴细胞功能检测结果
Table 3 ConA-induced proliferation and IL-2 synthesis by cells from AD patients(
| Control | Mild AD | Moderately severe AD | |
| SI(%) | 7.1±1.2 | 5.5±1.3 | 4.2±1.1 |
| IL-2(pg/ml) | 62.9±2.1 | 68.7±2.4 | 74.9±3.4* |
| IL-2R(%) | 6.4±1.0 | 6.4±0.9 | 5.8±0.5 |
| sIL-2R(pg/ml) | 1197.9±32.9 | 1533.8±47.8* | 1443.3±68.3* |
SI:stimulation index; IL-2R: interleukin-2 receptor; sIL-2R: soluble interleukin-2 receptor;
*t test vs controls, P＜0.05
3 讨论
近年来研究发现在AD患者脑组织病理变化中伴随某些脑内免疫反应［1］，但这是否作为机体免疫系统功能的一部分而表现出外周免疫功能指标的相应变化尚不清楚。国外已有报道试图采用外周免疫指标的检测来反映脑内免疫反应和AD病情变化，但结论不一［2～5］；这可能与患者的异质性和指标选择不同有关。因此，选择合适敏感的检测指标作为AD的生物标志物，对AD的诊断和探讨AD发病的免疫作用机制具有重要意义。
本研究通过检测不同病情AD患者外周血T细胞的免疫活性指标，以探讨机体外周免疫功能变化。结果表明：T细胞亚群组成中，CD4+和CD8+在轻度AD中略下降，而在重度AD中均呈上升趋势，但差异均无统计学意义；CD4+/CD8+比值均在正常范围内。结果与文献［2］相同，但不同于Pirttila T等［3］报道的AD患者CD8+T细胞减少和CD4+/CD8+比值增高，也不同于Shalit等［4］报道重度AD患者CD4+显著升高和CD8+轻度下降。T细胞增殖功能检测发现，AD病例组对ConA刺激的增殖能力有下降趋势，但与对照比较差异无显著性，结果与文献［6］报道类似。依据IL-2R表达在AD患者和对照之间差异无显著性和AD组IL-2分泌升高，其增殖下降的原因可能与AD的低白蛋白有关；Shalit等［4］则认为与T细胞跨膜信号传导受抑制有关。AD患者淋巴细胞IL-2分泌在重度AD组明显升高(P＜0.05)，结果与文献［5］相同，这与CD4+细胞在重度AD组中升高相一致，因为IL-2主要由CD4+辅助细胞分泌。sIL-2R表达功能在轻、重度AD组中均明显升高(P＜0.05)。sIL-2R来自于细胞膜上的低亲和力受体P55蛋白，可与IL-2R竞争与IL-2结合作为类似封闭因子，在免疫调节中具有重要的意义。肿瘤、自身免疫性疾病、器官移植排斥反应和艾滋病等疾病中血清sIL-2R表达明显升高［7］。本研究提示AD患者存在免疫抑制。
目前研究认为，血脑屏障具有比以往所认识的更强的可通透性，存在中枢和外周免疫系统之间的沟通，因此设想发生在AD脑内的免疫异常可在外周表现出来［4，8］。在本研究中，T淋巴细胞亚群变化与AD病情的联系不明显，将其作为区分AD疾病阶段的指标有待进一步探讨，而淋巴细胞因子IL-2分泌和sIL-2R表达等免疫参数应用于检测AD病程进展值得深入研究。
参考文献
1，Rogers J, Luber-Narod J, Styren SD, et al. Expression of immune system associated antigens by cells of the human central nervous system: relationship to the pathology of Alzheimer′s disease. Neurobiol Aging, 1988, 9:339-349
2，Iketa T, Yamaoto K, Takahashi K, et al. Immune system-associated antigens on the surface of peripheral blood lymphocytes in patients with Alzheimer′s disease. Acta Psychiatr Scand, 1991, 83:444-448
3，Pirttila T, Mattinen S, Frey H.The decrease of CD8 positive lymphocytes in Alzheimer disease. J Neurol Sci, 1992, 107(2):160-165
4，Shalit F, Serdni B, Brodie C, et al. T lymphocyte subpopulations and activation markers correlate with severity of Alzheimer′s disease. Clin Immunol Immunopathol, 1995, 75(3):246-250
5，Huberman M, Shalit F, Roth-Deri I, et al. Correlation of cytokine secretion by mononuclear cells of Alzheimer patients and their disease stage. J Neuroimmunol, 1994, 52(2):147-152
6，Leonardi A, Arata L, Bino GL，et al. Functional study of T lymphocyte responsiveness in patients with dementia of the Alzheimer type. J Neuroimmunol, 1989, 22:19-22
7，周世文，姚丹帆.可溶性白细胞介素2受体临床应用的进展.中国实验临床免疫学杂志，1991， 3(3)：43-45
8，Cserr HS, Knopf PM. Cervical lymphatics, the blood-brain barries and the immunoreactivity of the brain:a new view. Immunol Today, 1992, 13:507-511
(1999-01-19收稿)