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两株双价痢疾菌苗免疫小鼠后GALT中CD4+、CD8+ T细胞亚群的反应
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 疫苗学
作者：石辛甫 高杰英 彭红 邢丽 刘育红 陈志华 曾关富
单位：100850 北京 军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室
关键词：痢疾菌苗；肠粘膜；淋巴组织；T淋巴细胞亚群
【 摘要 】 目的 FSM-2117和FS-5416是两株具有不同生物表型的福氏、宋内氏双价痢疾菌苗株，FSM-2117无侵袭表型，无溶血活性，不表达侵袭蛋白抗原(Ipa-)，FS-5416则为Ipa+，本实验是为了观测两株菌苗(Ipa-，Ipa+)免疫后引起的肠粘膜相关淋巴组织(GALT)中的细胞免疫反应，以探明痢疾菌苗在肠粘膜的免疫保护机制。方法 以BALB/c小鼠随机分成两组，每组25只，灌胃免疫FSM-2117及FS-5416，8×108CFU/只，分别在1，4，7，10，13天随机取各组小鼠5只分离GALT淋巴细胞；同时设一组PBS对照组，以间接免疫荧光法检测GALT中诱导部位〔派伊尔小结(PP)、肠系膜淋巴结(MLN)〕及效应部位〔上皮间淋巴细胞(IEL)、粘膜固有层(LPL)〕T细胞亚群的变化，荧光显微镜计数200个细胞计算阳性率。结果 用SAS软件，单因素方差分析，表明两株双价菌苗株均可引起肠粘膜GALT中CD4+、CD8+淋巴细胞亚群改变，不同粘膜部位免疫反应不同。诱导部位(派氏小结、肠系膜淋巴结)CD4+细胞亚群明显升高，末次免疫后第7天达峰值，而后迅速下降；在效应部位，粘膜固有层表现为CD4+细胞亚群明显升高，而IEL主要表现为CD8+细胞亚群的升高，均于第7天达峰值。两株菌苗与对照组相比，差异都具有显著性（FSM-2117 P≤0.01，FS-5416 P＜0.01），但两菌苗株之间差别无统计学意义(P＞0.05)。结论 两株双价痢疾菌苗均可在小鼠GALT引起免疫反应，说明其均有较好的免疫原性。
Changes of CD4+ and CD8+ T subsets in GALT of mice after immunization with two different bivalent Shigella vaccines SHI Xinfu，GAO Jieying，PENG Hong，et al. Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Science, Beijing 100850
【 Abstract 】 Objectives FSM-2117 and FS-5416 are two bivalent hybrid strains of S. flexneri and S. sonnei, constructed by our laboratory. The differences of them are that the FS-54116 expresses four invasive plasimid antigens and has a good contact heamolysis activity(CHA+), but the FSM-2117 does not. To observe the mechanism of immune protection of Shigella vaccine, the changes of CD4+ and CD8+ T subsets in GALT in mice are detected.Methods BALB/c mice were divided into two groups, 25 mice per group. The two groups were immunized respectively with the two vaccines(8×108CFU/per mouse) four times with an interval of seven days by pouring the vaccine down the throat. The Peyer's patch(PP), mesenteric lymph nodes(MLN), intraepithelial(IE), lamina propria(LPL) and spleen(SP) lymphocytes were isolated of the same time on the first, fourth, seventh, tenth, thirteenth day at random after immunization. A PBS immunized group was detected as control. An indirect immuno-fluorescence assay was done. And 200 cells were counted under fluorescence-microscope.Results The data were analysed with SAS software (ANOVA). And it could be observed that the CD4+ subset of the two immunized groups showed a significant rise in PP and MLN of induced sites and LP effective site, and the CD8+ subset rose in IE of effective sites. The responses of both the two groups were significantly different from that of controls(FSM-2117, P≤0.01,FS-5416 P＜0.01).Conclusions Immunization with the two Shigella vaccines can result in immune responses in GALT in mice, and both two vaccines have better immunogenicity.
【 Subject words 】 Bivalent Shigella vaccine GALT CD4+ CD8+ T subset
细菌性痢疾是我国常见病及多发病，痢疾菌苗的研制受到普遍重视，但其免疫机理的研究国内外报道很少，我们对两株双价痢疾菌苗在小鼠GALT,尤其是效应部位的CD4+ 、CD8+ T细胞亚群的观察，为痢疾菌苗的研制提供了一定的理论依据。
材料和方法
1.实验动物：BALB/c 小白鼠，雄性，8～10周龄，本院动物中心提供。
2.菌苗株：FSM-2117(Ipa-)、 FS-5416(Ipa+)，本室构建并保存。
3.淋巴细胞分层液：Percoll(比重=1.130)；Pharmercia产品。
4.消化所用酶：Collegenase (type Ⅲ Ⅳ), Sigma产品。
5.间接免疫荧光法所用试剂：大鼠抗小鼠CD4、CD8单抗、FITC-兔抗大鼠单抗，购于北医免疫室。
6.抗原制备：取FSM-2117及FS-5416干燥菌种活化12小时，转种贺氏肉汤培养8小时，离心，PBS洗两次，比浊管计数，悬成1.6×109 CFU/ml，待用。
7.灌胃免疫法：两组小鼠分别用两组菌苗PBS悬液灌胃免疫，每只小鼠每次8×108 CFU / 0.5ml，共免疫4次，每次间隔7天，对照组以同体积PBS灌胃。
8.细胞悬液制备：(1)脾淋巴细胞悬液的制备：取小鼠数只，颈椎脱臼处死，取脾脏，置5%FCS RPMI 1640培养液中；100目不锈钢细胞筛研磨，过滤，滤液离心洗两次，1000r/min，5分钟；细胞沉淀加入Tris-NH4Cl 10ml，10分钟，破坏红细胞，离心后重悬，然后用淋巴细胞分层液分层，轻取界面细胞，培养液洗两次，悬成106/ml，2%台盼蓝染色，活细胞计数大于95%，纯度大于97%。
(2) 肠系膜淋巴结淋巴细胞制备：与脾脏淋巴细胞制备相似，但不用破坏红细胞。
(3) 派伊尔小结淋巴细胞悬液制备：同肠系膜淋巴结淋巴细胞制备。
(4) IEL及LPL制备：参照文献〔1，2〕进行。①BALB/c小白鼠5～7只，脱颈处死，取出小肠，0.01mol/L CMF-HBSS冲洗肠内容物，至干净，然后剪去派氏小结，纵行剖开小肠，然后剪成1～2cm小段。②组织放入盛有30ml 5%FCS 完全RPMI 1640培养液的三角烧瓶中，37℃，振荡30分钟，装入带盖的50ml塑料离心管中，猛摇15～20秒，然后100目钢网过滤。余组织重复②两次以上。收集滤液，离心洗两次，重悬待用。③剩余组织5%FCS RPMI 1640洗两次，平皿中剪碎，放入三角烧瓶中，加入20ml 5% RPMI 1640，再加入胶原酶Ⅳ使成1mg/ml，胶原酶Ⅲ25U/ml，37℃摇床振荡2小时，放入搅拌子，磁力搅拌10分钟，消化液100目不锈钢细胞筛过滤，滤液洗两次，重悬。④过尼龙毛柱：尼龙毛少许，松松放入10ml注射器内，用培养液浸湿，将上述两滤液分别过滤，滤液洗一次，悬于适量培养液中。⑤分层：Percoll原液(比重=1.130)，9份Percoll原液，加入一份10×HBSS液配成100% Percoll分层液，再以5% FCS 完全RPMI 1640液配成40%，55%，75%浓度混匀待用。尖底细胞离心管数只，每只加入2ml 75%分层液，依次缓缓加入55%,40%分层液(分离IEL不必加55%层)，勿使界面相混；然后轻轻加入15ml细胞悬液，水平离心，1500r/min，30分钟，然后轻取界面细胞层，培养液洗两次，2%台盼蓝活细胞计数大于90%，纯度大于90%，待用。
9. 间接免疫荧光实验：常规操作，结果以荧光显微镜观察，至少观测200个淋巴细胞，计数荧光阳性细胞百分率。
结 果
用间接免疫荧光方法观测末次免疫后1，4，7，10，13天粘膜免疫诱导部位PP、MLN，效应部位IEL、LPL及SPL中CD4+和CD8+ T细胞亚群的百分率，结果分别列于表1，2。可见，不同GALT部位T淋巴细胞亚群免疫反应曲线走向是不同的，但两菌苗株变化规律基本一致。①在正常小鼠除IEL CD4+细胞亚群较低外，其它部位细胞亚群均较接近，CD8+细胞亚群除在IEL较高外余也较接近；②两双价菌苗株免疫后，粘膜免疫诱导部位MLN、PP主要表现为CD4+ T 细胞亚群上升，CD8+ T 细胞亚群也有升高，但不如CD4+ T 变化明显。③两菌苗株免疫后，效应部位上皮间(IE)主要表现为CD8+ T 细胞亚群升高，CD4+ T 细胞亚群在第4天增高，但绝对值较低；固有膜(LP)则表现为CD4+ T 细胞亚群升高，而CD8+ T 细胞亚群变化不明显。④诱导部位与效应部位相比，LP中CD4+ T 细胞亚群升高较诱导部位稍晚。⑤Ipa+株与Ipa－株相比，诱导部位PP、MLN CD4+ T 细胞亚群上升较早，在第1天、第4天高于Ipa－株；CD8+ T 细胞亚群在PP结第四天明显高于Ipa－株，在MLN，两者的变化规律较一致。数据经统计学处理，Ipa－株与PBS：P≤0.01，Ipa+株与PBS：P＜0.01，Ipa+株与Ipa－株：P＞0.05。⑥另外，尚发现SPL亦有变化，两菌苗株免疫后CD4+ T 细胞亚群升高，Ipa+株免疫组CD4+ T 细胞亚群在第一天即明显有升高。
表1 两菌苗株免疫a小鼠后GALT CD4+淋巴细胞亚群的变化
Table 1. Changes of CD4+ T lymphocyte subsets in GALT of mice after immunization
| T cell percent (%)b |
| Groups Daysc SP MIN PP IE LP |
| PBS 1 15.90±1.27 17.28±2.43 14.00±2.05 0.75±0.10 17.28±2.43 |
| Ipa- 1 23.16±1.95 27.62±1.76 19.98±1.1 50.70±0.14 17.72±1.31 |
| 4 20.96±2.43 25.08±1.33 24.86±0.9 48.90±1.09 29.86±1.23 |
| 7 30.96±1.15 54.30±1.04 53.72±0.9 94.58±1.32 51.94±2.82 |
| 10 26.66±2.03 18.26±3.24 29.72±3.19 3.72±1.18 14.28±1.06 |
| 13 15.38±2.71 14.60±2.38 12.12±1.44 1.34±0.82 12.84±2.43 |
| Ipa+ 13 7.66±1.50 38.34±1.05 31.64±2.35 0.90±0.12 20.70±1.73 |
| 4 26.34±1.01 31.20±1.02 40.80±0.90 11.22±0.81 34.80±1.14 |
| 7 31.48±2.64 51.42±1.79 54.12±1.70 5.32±1.15 49.78±2.29 |
| 10 21.94±1.99 14.66±2.31 26.36±4.88 3.02±0.93 14.48±1.19 |
| 13 14.60±1.92 14.66±2.30 12.44±1.7 11.24±0.53 19.98±2.22 |
a.Times of immunization =4； b. Value=
Table 2. Changes of CD8+ T lymphocyte subsets in GALT of mice after immunization
| T cell percent (%)b |
| Groups Daysc SP MIN PP IE LP |
| PBS 1 17.75±2.03 11.83±2.61 10.95±1.75 36.38±1.61 11.23±1.84 |
| Ipa- 1 31.14±1.21 24.66±2.73 23.68±1.51 42.80±1.96 22.32±2.25 |
| 4 30.04±1.01 21.94±0.77 17.06±1.89 48.70±1.04 26.36±0.50 |
| 7 35.96±1.44 17.52±0.99 29.38±0.71 63.40±1.61 14.88±1.38 |
| 10 16.12±2.08 12.14±2.23 20.16±2.27 22.24±2.89 10.92±2.44 |
| 13 15.76±2.44 24.90±2.06 12.14±2.20 23.94±1.53 12.56±1.36 |
| Ipa+ 1 36.48±1.78 23.92±1.26 16.00±1.12 38.78±0.93 15.04±0.94 |
| 4 21.68±0.63 21.12±2.17 34.28±0.79 48.50±1.78 24.48±0.89 |
| 7 28.88±1.87 18.58±1.20 31.90±1.69 67.72±2.21 12.50±1.44 |
| 10 12.96±2.69 13.20±2.63 15.22±2.63 33.14±1.59 13.88±2.10 |
| 13 19.50±1.32 25.80±1.94 13.50±2.35 37.50±2.00 11.92±1.61 |
a.Times of immunization =4； b. Value=
讨 论
小鼠T淋巴细胞表面抗原CD4、CD8是小鼠辅助及杀伤、抑制性T细胞表面特异性标志，诱导部位结果与我室用痢疾毒株Shigella flexneri 2a 口服免疫LACA小鼠两次的结果〔3〕基本一致，说明菌苗和毒株在诱导部位辅助性T细胞亚群的反应基本相同。但两个效应部位对免疫表现不同的反应，LPL以CD4+细胞亚群上升为主要表现，升高时间晚于诱导部位，第4天才有明显上升；IEL以CD8+细胞亚群升高为主要表现。肠粘膜两个效应部位有不同的免疫细胞，LPL以浆细胞、T细胞为主，比例同外周淋巴细胞，而IEL绝大多数均为T细胞，而且以CD8+ T 细胞亚群为主，这是菌苗在两部位免疫反应不同的内在原因。Sinha等人报道，口服宋内毒株一次感染的豚鼠，6周后发现IEL T淋巴细胞亚群有明显上升〔4〕。似与本实验不符，但是所用动物、免疫原及免疫次数不同可能有一定关系。实验还发现Ipa+菌苗株与Ipa-菌苗株在GALT中的反应规律基本一致，但Ipa+菌苗株反应早于Ipa-菌苗株。以上结果表明，PP、MLN是粘膜免疫主要诱导部位，尤其PP结是特异性辅助T细胞的来源。据Zeitz等人的研究证明，LPL大多数是分化末期细胞，对抗原刺激不表现增殖，而是通过功能增强来起作用〔5〕，因此增多的细胞可能来源于PP结。IEL 第4天虽有升高，但绝对值较小，意义似乎不大。IEL以CD8+ T细胞为主，实验证明它们具有NK细胞样CTL活性，其杀伤作用无特异性〔6〕，YH.Chien, Palo Alto, CA也有报道，IEL中TCRγδ+ T细胞对表面抗原或致病原表现抗体样识别，而不要求抗原提呈〔7〕。但它们是否参与痢疾菌的粘膜免疫反应，尚无直接证据，而且，IEL表型复杂，CD4+CD8－、CD4+CD8+、CD4－CD8+均可分泌两类细胞因子，前两类同时具有TH1、TH2辅助细胞功能〔6〕，但在痢疾菌苗免疫中起什么作用、如何作用尚待进一步研究。本实验中发现IEL细胞亚群升高，但有什么作用尚不清楚，CD4、CD8双标记及结合功能实验可能有助于这个问题的解决。
本课题受国家863计划经费资助(课题号：102-07-03-03)
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(收稿：1997-11-17 修回：1998-06-02)