肠出血性大肠埃希氏菌的多重PCR检测方法

肠出血性大肠埃希氏菌的多重PCR检测方法

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 免疫检测

作者：李怡　徐建国

单位：李怡（现通讯地址：450003 郑州，河南省人民医院省遗传研究所）；徐建国（102206 北京,中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所，卫生部分子医学细菌学重点实验室）

关键词：大肠杆菌；溶血素类；毒素类；聚合酶链反应

　　【 摘要 】　目的　开发肠出血性大肠埃希氏菌(entero-hemorrhagic E.coli,EHEC)的多重PCR检测方法。方法　以溶血素(hemolysin, hly)基因和志贺样毒素(Shigalike toxin,SLT)基因为靶基因，进行了研究。结果　发现SLT1-hly组合能够检测出产生SLT1毒素的EHEC菌株，SLT2-hly组合能够检测出产生SLT2的EHEC菌株，SLTs-hly组合能够检测出所有产生SLT1和SLT2的EHEC菌株。结论　实验证明，把这3种多重PCR方法结合使用，能够快速地检测和鉴定EHEC菌株，能够比较准确地了解所检测菌株产生志贺样毒素的情况，为EHEC的检测工作提供了一种更加方便易行的技术。

　　Development of multiplex PCR methods for detection of enter-hemorrhagic E. coli　LI Yi, XU Jianguo. Priority Laboratory of Molecular Medical Bacteriology, Ministry of Health, Institute of Epidemiology and Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 102206

　　【 Abstract 】　Objective　To develop multiplex polymerase chain reaction(PCR) method for detection of entero-hemorrhagic E. coli (EHEC).Methods The virulence genes of hemolysin(hly) and Shiga-like-toxin(SLT) were chosen as the target genes.Results　With these PCR methods, all of the EHEC strains having SLT1 and hly genes could be detected with hly-SLT1 pair, all of the EHEC strains having SLT2 and hly genes could be detected with hly-SLT2 pair. With hly-SLTs pair, all of the EHEC strains having hly and SLT1 or SLT2 genes could be easily detected.Conclusions　If the three PCR pairs are used concurrently, EHEC strains could be easily detected; the non-EHEC Shiga-like-toxin producing E.coli could be easily distinguished. And, the virulence factors of the tested strains could also be clarified.

　　【 Subject words 】　Escherichia coli　　 Hemolysin　　Shiga-like-toxin　　Polymerase chain reaction

　　新发现的病原微生物和重新抬头的病原微生物是当前世界医学界面临的一个新的课题。O157∶H7大肠埃希氏菌就是其中之一。它在分类学上属于肠出血性大肠埃希氏菌(entero-hemorrhagic E.coli EHEC)。从产生志贺样毒素的角度来看，O157∶H7大肠埃希氏菌也属于产志贺样毒素的大肠埃希氏菌(Shiga-like-toxin producing E.coli, SLTEC)。EHEC因为能引起出血性肠炎而得名，主要包括O157∶H7血清型菌株，还包括O26∶H11、O111等血清型的部分菌株等。近年来也有关于无动力的O157菌株(O157∶NM)引起出血性肠炎和溶血性尿毒综合症的报道^〔1〕。我国也先后分离到了O157∶H7大肠埃希氏菌和非O157血清型的EHEC株^〔2，3〕。EHEC的主要毒力因子有溶血素(hemoly-sin，hly)，志贺样毒素(Shiga like toxin,slt)和eae基因^〔1〕。并根据这些基因发展了DNA探针和PCR检测方法^〔4，5〕。根据溶血素基因发展的EHEC特异性DNA探针和PCR检测方法能够检测O157∶H7和其它血清型的EHEC菌株，但不能反映产志贺样毒素的情况^〔4，5〕。根据志贺样毒素发展的DNA探针和PCR方法，不能够准确地将EHEC和EPEC(致肠道病大肠杆菌)区分开来，因为许多EPEC菌株也产生志贺样毒素^〔6-9〕。本研究发展了检测EHEC菌株的多重PCR方法，可同时检测溶血素基因和志贺样毒素基因(Shiga-like toxin,SLT)可以将EHEC和EPEC区分开来。现将结果报道如下：

　　材料与方法

　　1.菌株：试验所用的参考菌株及特性见表1。惠赠菌株的有江苏省徐州市防疫站权太淑主任医师，山东省防疫站菌种室和美国马利兰大学医学院MM Levine博士^〔2，4〕。

　　2.试剂：Taq DNA聚合酶、dNTPs、分子量标准λDNA/HindⅢ、λDNA/EcoRⅠ/HindⅢ、PCR markers、RNase等均购自华美生物工程公司。PCR DNA扩增仪为中国医学科学院遗传学研究所生产。

　　3.引物：

　　(1)EHEC特异性PCR引物参考文献〔5〕。检测溶血素基因hly AB，产物为338bp。

　　(2)SLT1a 5'-AGT TAA TAT GGT GGC GAA；SLT1b 5'-GAC TGC GTC AGT GAG GTT。检测志贺样毒素1，产物为447bp。

　　(3)SLT2a 5'-TTC GGT ATC CTA TTC CCG；SLT2b 5'-TCT CTG GTC ATT GTA TTA。检测志贺样毒素2，产物为447bp。

　　(4)SLTsa 5'-TTT ACG ATA GAC TTC TCG AC;SLTsb 5'-CAC ATA TAA ATT ATT TGCG CTC。可检测SLT1和SLT2。SLT1产物为224bp,SLT2的产物为227bp^〔9〕。

　　4.模板制备：本研究采用两种方法制备模板DNA。(1)使用小量提取的染色体DNA作为模板。(2)水煮法：将细菌过夜振荡培养。取1ml细菌的过夜培养物至一离心管，12000r/min离心30秒后，去上清，加入100μl三蒸水，混匀，煮沸10分钟，12000r/min离心30秒后，取上清直接用于PCR扩增。

　　5.普通PCR扩增反应：PCR反应总体积为25μl。在0.5ml Eppendorf管中按顺序加入三蒸水15.5μl,10×buffer(MgCl₂ 15mmol/L)2.5μl,dNTPs(每种dNTP溶液浓度分别为0.2mmol/L)2.5μl，引物(每条引物的浓度为0.5μmol/L)1.0μl,模板DNA 2.0μl，Taq DNA聚合酶(3U/μl)0.5μl。最后加入石蜡油50μl。

　　反应程序

　　EHEC特异性PCR(hly基因)：94℃ 10分钟，变性模板DNA，然后94℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环。

　　SLT1：94℃ 10分钟，变性模板DNA，然后94℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环。

　　SLT2：94℃ 10分钟，变性模板DNA，然后94℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环。

　　SLT1和SLT2：94℃ 10分钟，变性DNA，然后94℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环。

　　6.多重PCR(MPCR)：MPCR反应总体积为25μl，在0.5ml Eppendorf管中按顺序加入三蒸水13.5μl,10×buffer(无镁离子)2.5μl，dNTPs各2.5μl，每条引物1.0μl，模板2.0μl,Taq DNA聚合酶0.5μl，石蜡油50μl。

　　反应程序

　　hly-SLT1和hly-SLT2:94℃ 10分钟，变性DNA，然后94℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 2分钟，30个循环。

　　hly-SLTs:94℃ 10分钟，变性DNA，然后94℃ 1分钟，45℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环。

　　7.PCR产物检测：用(1.5～2.0)%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。在紫外灯下观察，使用照相系统记录试验结果。

　　结　果

　　PCR检测结果：使用针对hly的引物，对21株EHEC菌株(包括1株O26∶H11血清型的EHEC菌株)进行了检测。所有21株菌均能产生大小为338bp的PCR产物。使用针对SLT1的引物进行PCR试验，TX1、TX2、TX4、85-998、85-1128、SD4、SD15和SD16菌株为阴性结果，其余菌株为阳性结果。使用针对志贺样毒素2的引物对21株E.coli O157∶H7和4株非O157∶H7菌株进行PCR扩增，结果除徐州菌株12754和来源于美国的O26∶H11 EHEC菌株外，其余菌株均为阳性结果。PCR检测的结果和过去使用DNA探针检测的结果一致(表1)^〔4，5〕。使用可同时检测出SLT1和SLT2基因的引物SLTs对上述菌株进行了检测，结果均为阳性。PCR产物的分子量和预期的相符，说明其敏感性是比较满意的。

　　多重PCR检测结果：鉴于针对SLT1、SLT2、SLTs和hly引物的检测结果，验证了多重PCR方法。结果发现，使用SLT1-hly的4条引物进行PCR反应时，所获得的结果和使用普通PCR的结果相同：TX1、TX2、TX4、85-998、85-1128、SD4、SD15和SD16不具有SLT1基因。其余菌株均为阳性结果。使用SLT2-hly的4条引物同时进行多重PCR试验，所获得的结果和普通PCR试验的结果相同。徐州菌株12754和来源于美国的O26∶H11大肠埃希氏菌不具有SLT1基因，其余菌株均为阳性结果。使用SLTs-hly引物，所有含有SLT1或SLT2基因的EHEC菌株均呈现阳性结果(见表1和图1)。

　　　　　　　　　　　图1　多重PCR方法检测EHEC的结果

　　Fig 1. Detection for entero-hemorrhagic E.coli with multiple PCR method

　　Lane 1:Molecular weight standard;lane 2:hly+SLT1;lane 3:hly+SLT2;lane 4:hly+SLTs;lane 5:hly;lane 6:SLTs;lane 7:SLT2;lane 8:SLT1;lane 9:molecular weight marker;

　　The size of PCR products are as follows：hly:338bp;SLT1:447bp;SLT2:447bp;SLTs:224bp(SLT1)or 227bp(SLT2)

　　表1　普通PCR和多重PCR的试验结果和菌株特性

　　Table 1. General and multiple PCR experiments and characteristics of E.coli strains used

Strain No.	Serotype	Source	DNA probe			General PCR			Multiple PCR
			SLT1	SLT2	hly	SLT1	SLT2	hly	SLT1+hly	SLT2+hly	SLTs+hly
933W	157∶H7	US	+	+	+	+	+	+	+ +	+ +	+ +
TX1	157∶H7	JA	ND	ND	+	-	+	+	- +	+ +	+ +
TX2	157∶H7	JA	ND	ND	+	-	+	+	- +	+ +	+ +
TX3	157∶H7	JA	ND	ND	+	+	+	+	+ +	+ +	+ +
TX4	157∶H7	JA	ND	ND	+	-	+	+	- +	+ +	+ +
TX5	157∶H7	JA	ND	ND	+	+	+	+	+ +	+ +	+ +
TX6	157∶H7	JA	ND	ND	+	+	+	+	+ +	+ +	+ +
TX7	157∶H7	JA	ND	ND	+	+	+	+	+ +	+ +	+ +
85-988	157∶H7	US	+	+	+	+	+	+	+ +	+ +	+ +
85-1003	157∶H7	US	+	+	+	+	+	+	+ +	+ +	+ +
85-777	157∶H7	US	+	+	+	+	+	+	+ +	+ +	+ +
85-998	157∶H7	US	-	+	+	-	+	+	- +	+ +	+ +
85-1128	157∶H7	US	-	+	+	-	+	+	- +	+ +	+ +
85-1004	157∶H7	US	+	+	+	+	+	+	+ +	+ +	+ +
SD1	157∶H7	SD	ND	ND	+	+	+	+	+ +	+ +	+ +
SD3	157∶H7	SD	ND	ND	+	+	+	+	+ +	+ +	+ +
SD4	157∶H7	SD	ND	ND	+	-	+	+	- +	+ +	+ +
SD15	157∶H7	SD	ND	ND	+	-	+	+	- +	+ +	+ +
SD16	157∶H7	SD	ND	ND	+	-	+	+	- +	+ +	+ +
5203	157∶H7	SD	ND	ND	ND	+	+	+	+ +	+ +	+ +
12754	157∶H7	SD	ND	ND	ND	+	-	+	+ +	- +	+ +
HB101					-	-	-	-	- -	- -	- -
8401		BJ	ND	ND	ND	-	-	-	- -	- -	- -
O26∶H11		US	ND	ND	+	+	-	+	+ +	- +	+ +

　　US:United States;JA:Japan;SD:Shandong province;BJ:Beijing

　　讨　论

　　EHEC感染已经成为世界性的问题，发展特异、敏感、快速、经济的检测方法，对病原菌的检测、鉴定和流行病学调查都是十分重要^{〔1，4，5〕}。目前世界上现有的EHEC检测方法主要是对其毒力基因和独特性的检测，如志贺样毒素1和2、溶血素基因及山梨醇不发酵等特征^〔1〕。但是，鉴于EHEC的PCR试验方法多是检测志贺样毒素^〔6～8〕，由于一部分非EHEC的菌株也产生志贺样毒素，这些方法的应用受到很大的限制^〔1，3〕。

　　基于EHEC特异性DNA探针在世界范围内的广泛使用和满意结果，我们对这个3.3kb的DNA片段进行了序列分析，发现其编码1种溶血素基因(hly)^〔4，5〕。E.coli O157∶H7的hly和其它细菌的hly基因在DNA序列和氨基酸序列上均有区别。根据O157∶H7大肠埃希氏菌hly的特异性序列发展了EHEC特异性PCR试验方法。其特异性和敏感性都比较令人满意^〔5〕。hly基因曾被作为肠出血性大肠埃希氏菌特异性DNA探针，在世界范围内得到印证。因此，以hly基因为基础的出血性大肠埃希氏菌PCR检测方法，在理论和实际上都有着其它方法不可比的优越性^〔4，5〕。

　　我们把SLT1、SLT2和SLTs(可检测SLT1和SLT2)引物和hly引物进行组合，进行了多重PCR试验。结果表明，SLT1-hly组合能够检测出产生SLT1毒素的EHEC菌株，SLT2-hly组合能够检测出产生SLT2的EHEC菌株，SLTs-hly的组合能够检测出产生或不产生志贺样毒素的EHEC菌株。把这3种多重PCR方法结合使用，就能够比较快速的检测和鉴定EHEC菌株，并且能够比较准确地了解所检测菌株产生志贺样毒素的情况。这对开展EHEC的检测工作提供了一种更加方便易行的方法。Fratamico曾经发展了一种针对溶血素基因和eae基因的EHEC多重PCR检测方法，但是该方法不能够反映检测菌株产生志贺样毒素的情况^〔9〕。Lang曾经发展了一种针对志贺样毒素和热不稳定毒素的多重PCR方法，但是该方法很难应用于EHEC的检测^〔10〕。比较起来，我们根据自己设计的针对溶血素基因的特异性引物，结合Fratamico等人设计的针对志贺样毒素的引物而发展的EHEC特异性PCR检测方法，与已经发表的检测EHEC的方法相比，具有优越性^〔5，9〕。

　　本课题受国家自然科学基金资助(课题编号：39625001)

　　参考文献

　　[1]徐建国，祁国明.肠出血性大肠埃希氏菌的临床、检测方法和流行病学特征.中华流行病学杂志，1996，12(17)∶367-369.

　　[2]Xu Jianguo,Quan Taishu,Xiao Donglou,et al.Isolation and characterization of Escherichia coli O157∶H7 strains in China.Curr Microbiol,1990,20∶299-303.

　　[3]Xu Jianguo,Cheng Bokun,Wu Pingyang,et al.Cell adherence patterns and DNA probe types of E. coli strains isolated from diarrheal patients in China.Microbiol Immunol,1996,40(2)∶88-99.

　　[4]Levine MM,Xu Jianguo,James B.Kaper,et al.A DNA probe to identify enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7 and other serotypes that cause hemorrhagic colitis and emolytic uremic syndrome.J Infect Dis,1987,156∶175-182.

　　[5]徐建国，黄力保，吴纪民.一种出血性大肠埃希氏菌的PCR检测方法.中华医学检验杂志，1995，18(4)∶225-228.

　　[6]Brian MJ,Frosolono M,Murray BE,et al.Polymerase chain reaction for diagnosis of enterohemorrhagic Escherichis coli infection and hemolytic-uremic syndrome.J Clin Microbiol,1992,30∶1801-1806.

　　[7]Ritchie M,Paritngton S,Jessop J,et al.Comparison of a direct fecal Shiga-like toxin assay and sorbitol-MacConkey agar culture for laboratory diagnosis of enterohemorrhagic Escherichia coli infection.J Clin Microbiol,1992,30∶461-464.

　　[8]Meng J,Zhao S,Doyle MP,et al.Polymerase chain reaction for detecting Escherichia coli O157∶H7. Int J Food Microbiol,1996,32∶103-113.

　　[9]Fratamico PM,Sackitey SK,Wiedmann M,et al.Detection of Escherichia coli O157∶H7 by multiplex PCR.J Clin Microbiol,1995,33∶2188-2191.

　　[10]Lang AL,Tsai YL,Mayer CL,et al.Multiplex PCR for detection of the heat-labile toxin gene and Shiga-like toxin Ⅰ and　Ⅱ genes in Escherichia coli isolated from natural waters.Appl Environ Microbiol,1994,60∶3145-3149.

(收稿：1997-10-30　　修回：1998-04-16)