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北方汉族人群HLA-A2亚型分布及p53的合成肽体外诱导CTL反应
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 基础免疫学
作者：侯亚非 孙宗棠 E.Appella 曲春枫 吴志远 C.C.Harris
单位：侯亚菲 孙宗棠 曲春枫 吴志远（100021 北京，中国医学科学院，中国协和医科大学肿瘤研究所分子免疫室）；E.Appella,C.C.Harris（National Cancer Institute，NIH，Berthesda MD，USA）
关键词：HLA-A2抗原；合成肽抗原；蛋白质p53；树突细胞
【 摘要 】 目的 研究北方汉族人群中HLA-A2亚型的分布及树突状细胞提呈基于p53基因合成肽体外诱导特异性T杀伤细胞(CTL)反应的影响。方法 利用PCR-SSP技术分析北方汉族人群中HLA-A2基因型及其亚型的分布，并在适当A2亚型背景下，选择与HLA-A201分子具有高亲和性的2个来自p53蛋白及1个来自HBV核心抗原的蛋白合成多肽，将其分别负载到经体外GM-CSF+IL-4刺激增殖的人脐带血树突状细胞（DC）上，诱导自身外周血单个核细胞（PBMC）多肽特异性CTL反应。结果 200例北京正常个体中共有53例HLA-A2型，其中以A201及A207亚型分布最多，亚型分布较分散；在GM-CSF+IL-4刺激下获得的典型DC培养后期加入TNF-α，可增加其HLA-Ⅰ类及Ⅱ类分子的表达；多肽p53149～157，p53264～272，HBVc18～27均可诱导出HLA-A201分子限制的自身PBMC肽特异性的CTL，然而，只有p53264～272经多次刺激才诱导出HLA-A207分子限制的肽特异性CTL。结论 北京人群HLA-A2基因型分布具有独特性；从人脐带血获得的DC肽疫苗可以使自身p53蛋白多肽抗原打破机体的外周耐受状态而诱导出CTL反应；HLA-A2分子个别位置上氨基酸的差异可显著影响其提呈抗原多肽的能力。
HLA-A2 subtype distribution among Beijing Chinese and its effect on CTL response in vitro to p53 protein based synthetic peptides loaded on dendritic cells HOU Yafei*, SUN Zongtang, E.Appella,et al. *Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Beijing 100021
【 Abstract 】 Objective To explore the HLA-A2 subtype distribution among Beijing Chinese and its effect on CTL response in vitro to p53 protein based synthetic peptides loaded on dendritic cells.Methods The distribution of HLA-A2 genotype and subtypes were analyzed with PCR-SSP.The p53149-157, p53264-272,and HBVc18-27 which had high affinity with HLA-A201 molecule, were loaded individually on human umbilical cord blood dendritic cells cultured with GM-CSF+IL-4 to induce specific CTLs.Results There were 53 cases of HLA-A2 genotype among 200 healthy Beijing Chinese , HLA-A201 and A207 were the two major subtypes. Dendritic cells (DC), cultured with GM-CSF+IL-4, showed enhanced HLA-Ⅰ and HLA-Ⅱ molecules expression following subsequent addition of TNF-α.HLA-A201 restricted CTL responses specific to all the studied peptides were readily induced from autologous PBMC by peptide loaded to the DCs. However, HLA-A207 restricted CTL response could only be induced by repeatedly using peptide p53264-272.Conclusions The distribution profile of HLA-A2 subtypes among Beijing Chinese is relatively unique. DC obtained from human cord blood could be used as an effective adjuvant of peptides to overcome the self-tolerance to p53 to induce specific CTL responses. Change of one amino acid in the peptide binding region of A2 molecule might significantly influence the antigen presenting ability of certain peptides.
【 Subject words 】 HLA-A2 antigen Peptide vaccine Protein,p53 Dendritic cells
人类肿瘤中常存在p53基因的点突变，多伴有突变蛋白的过度表达〔1〕。作为内源性蛋白的p53若进入抗原提呈途径将被处理成短肽，与HLA-Ⅰ类分子结合后表达在细胞表面，为T细胞受体所识别〔2〕。而这种识别决定了肿瘤特异性T杀伤细胞（CTL）对瘤细胞的杀伤功能。由于合成性多肽也可直接与抗原提呈细胞（APC）表面相应的I类分子结合，并诱导肽特异性CTL反应，若来自p53蛋白序列的合成肽能与I类分子结合，并经适当的APC提呈后诱导出特异性CTL反应，对于开发针对突变p53蛋白的肿瘤肽疫苗具有重要意义〔3〕。目前认为，能够诱导CTL反应的多肽应与MHC I类分子具有一定的亲和性，才能在细胞表面形成稳定的复合物而被T细胞受体识别〔4〕。我们已对一系列来自p53蛋白及HBV核心抗原序列的合成肽与HLA-A201分子的亲和性进行了研究〔5〕，并选择3个结合A201分子的合成肽作为研究对象，进行体外诱导肽特异性CTL反应的试验。由于树突状细胞（DC）表达丰富的I、II类分子及辅助刺激分子，并且可从外周血干细胞诱导扩增出成熟的DC〔6〕，我们以人脐带血为DC前体细胞的来源，利用细胞因子诱导扩增的DC作为APC来提呈所筛选的抗原肽。目前HLA-A2存在17个以上亚型，并在不同种族中分布不同〔7〕。为了开发针对中国人群的合成肽疫苗，我们利用PCR-SSP技术分析北方汉族人群中HLA-A2各亚型的分布，在多见的A2亚型背景下研究p53多肽的免疫原性，并进一步探讨不同A2亚型对诱导肽特异性CTL反应的影响。
材料与方法
1.主要材料：174CEMT2（T2）细胞株由美国NCI赠送。p53合成肽p53149～157（STPPPGTRV）和p53264～272（LLGRNSFEV）以及HBVc合成肽HBVc18～27（FLPSDFFPSV）均利用ABI多肽合成仪合成并经HPLC纯化。人重组GM-CSF，重组IL-4，重组IL-2，及人TNF-β检测盒均购自美国R&D公司。PCR试剂购自美国PE公司。AIM-V培养液购自GIBCO。
2. PCR-SSP法进行HLA-A位点分型：方法见参考文献〔7，8〕，所用引物购自英国Bristol大学移植科学部。
3. PCR-SSP法进行HLA-A2亚型分析:PCR所用引物是根据文献〔8〕用ABI DNA合成仪制备。
4. 树突状细胞的体外培养：利用人淋巴细胞分离液从脐带血中获得单个核细胞，在1640完全培养液中37℃、5% CO2孵育过夜。去除悬浮细胞，在贴壁细胞中加入含rGM-CSF和rIL-4各1000U/ml的1640完全培养液置上述孵箱中继续培养。第8天加入rTNF-α 100U/ml，第9天到第10天收获悬浮的DC进行表型检测。
5. 肽特异性CTL的体外诱导：在培养的树突状细胞孔中加入含试验肽50μg/ml及β2-微球蛋白3μg/ml的无血清AIM-V培养液，26℃、5% CO2孵箱培养4小时洗涤后作为刺激细胞。在刺激细胞培养孔中加入自身单个核细胞，6×106 细胞/每孔，37℃、5% CO2孵箱培养24小时后，加入等体积含rIL-2 20U/ml的AIM-V培养液继续培养7～10天。
6. 用3H-TdR释放法检测CTL的杀伤活性：方法见参考文献〔9〕。特异性DNA释放率按如下公式计算：
特异性DNA释放率（%）=（1－实验组cpm均值/对照组cpm均值）×100%
7. 检测肽特异性CTL分泌TNF-β的能力：按前述方法用肽处理DC或T2细胞作为靶细胞，细胞浓度为每孔104/0.1ml，加入效应细胞0.15ml，效靶比为10∶1。37℃、5% CO2孵箱培养24小时，收集各孔上清，按照试剂盒说明书，通过ELISA方法检测上清中TNF-β的浓度。所测吸光度（A）均值大小与样品中TNF-β浓度呈线性关系，因此可反映样品中TNF-β浓度大小。
结 果
1. 北京正常汉族人群中HLA-A2亚型的分布：通过血库随机采集了北京地区健康的汉族志愿献血者156个血样及44份脐带血。提取DNA后，对此200名个体的HLA-A位点进行分析，共有53例属HLA-A2型，其中2例为HLA-A2位点纯合子。对HLA-A2样品进行A2亚型分析，结果见图1。各基因亚型分布为A201（20/55），A207（12/55），A210（5/55），A203（4/55），A212（3/55），A206、A209、A213以及A217均为（2/55），A204、A208以及A211均为（1/55）。显示北京汉族人群中以A201亚型分布最多，其次为A207亚型。另外，A2各亚型分布种类较多，包括除A202、A205、A214、A216以外的所有已知的A2亚型。
图1 北京汉族人群中HLA-A2各亚型的分布
Fig 1. Distribution of HLA-A2 subtypes among the Beijing Han Chinese
2. 人树突状细胞的体外培养以及表型和功能检测：利用GM-CSF和IL-4从脐带血中扩增出的树突状细胞第10天左右停止增殖，呈悬浮生长，出现典型的树突样突起。通过流式细胞仪分析培养的细胞表型显示，这些细胞几乎不表达T细胞标志CD3、B细胞标志CD19和单核细胞标志CD14，却表达丰富的HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分子以及辅助刺激分子CD80和CD86。此外，发现培养后期加入TNF-α可明显增加树突状细胞HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分子的表达（图2）。单向混合DC-淋巴细胞反应显示，培养细胞的异型抗原刺激能力明显大于PBMC（结果未显示）。表型分析结合形态学特点以及异型抗原刺激功能均说明培养细胞正是树突状细胞。
图2 TNF-α可增加培养后期树突状细胞表面HLA-Ⅰ类及Ⅱ类分子的表达
Fig 2. Enhanced expression of HLA class Ⅰand Ⅱmolecules following subsequent addition of TNF-α
DCs were pre-treated with anti-HLA A,B,C and anti-HLA-DR antibodies and analysed by FACS
3. 以自身树突状细胞为抗原提呈细胞体外诱导HLA-A201限制的多肽特异性CTL反应：确定脐带血为A201亚型后，利用树突状细胞结合试验肽后从自身单个核细胞中诱导肽特异性CTL反应。由于T2细胞经与A201分子有亲和性的肽处理后高水平表达A201分子/多肽复合物，因此可作为CTL的杀伤靶细胞。图3显示，肽p53149～157，p53264～272和HBVc18～27均可诱导出肽特异性CTL反应，明显杀伤结合相应肽的T2细胞，杀伤对照靶细胞的活性很弱。从另一途径研究CTL对靶细胞的识别和反应能力，又观察了在靶细胞的诱导下CTL特异性分泌TNF-β的情况。图4显示，3个试验肽诱导出的CTL均可识别T2细胞结合的相应肽而特异性分泌TNF-β，且CTL分泌TNF-β的能力与其杀伤靶细胞的能力相一致。
图3 HLA-A201限制的树突状细胞提呈抗原肽后诱导CTL对靶细胞的杀伤活性
Fig 3. Cytotoxicity of CTLs induced by HLA-A201 restricted DCs pulsed with antigenic peptides
Target cell:T2 cell.1#Pep:p53149～157; 2#Pep:p53264～272;3#Pep:HBVc18～27.1#CTL,2#CTL and 3#CTL represent the effector cells which were induced by DCs pulsed with 1#Pep,2#Pep and 3#Pep,respectively
图4 HLA-A201限制的树突状细胞提呈抗原肽后诱导CTL特异性分泌TNF-β的能力
Fig 4. Specific TNF-β secretion of CTLs induced by HLA-A201 restricted DCs pulsed with antigenic peptides
Legend same as figure 3. None denotes T2 cells without peptide as control
4. 以自身树突状细胞为抗原提呈细胞体外诱导HLA-A207限制的多肽特异性CTL反应：为了研究能诱导HLA-A207限制的CTL反应，选择配型为A207的脐带血建立树突状细胞结合抗原肽后与自身淋巴细胞的混合培养系统。图5显示，只有肽p533264～272经多次诱导出的CTL可在结合此肽的自身DC刺激下特异性分泌TNF-β，而肽p53149～157和HBVc18～27则未能诱导出肽特异性CTL反应。抗CD8抗体加补体处理效应细胞可抑制其分泌TNF-β的能力，进一步说明效应细胞是CD8阳性的CTL。
图5 HLA-A207限制的树突状细胞提呈抗原肽后诱导CTL特异性分泌TNF-β
Fig 5. Specific TNF-β secretion of CTLs induced by HLA-A207 restricted DCs pulsed with antigenic peptides
Legend same as figure 3. Stimulator cell; autologous DCs.CD8+C';effector cells were pre-treated with CD8 antibody and complement.None denotes DC without peptide as control
讨 论
本研究分析了北方汉族人群中HLA-A2亚型的分布。与其他种族A2亚型分布相比较〔7〕，北京地区汉族人群中A2亚型种类较多，不论从分布还是分布频率来看，北京人与白人及黑人的A2亚型谱有着明显差别，尤其是北京地区汉族所缺少的几个亚型正是非洲黑人较多分布的A205系列亚型。而且北京人与新加坡华人〔7〕的A2亚型在分布频率上也有所不同，表现出北京人群A2亚型独特的分布特征。北京汉族人群主要以A201和A207亚型为主，因此选之作为研究的HLA背景。从体外诱导肽特异性CTL反应的情况来看，与A201分子具有亲和性的3个多肽在树突状细胞的提呈下均可诱导出HLA-A201限制的CTL反应。说明从脐带血获得的树突状细胞具有效的肽疫苗佐剂的效应。3个抗原肽中的两个p53多肽均来自p53蛋白的正常序列，来自乙肝病毒核心抗原的HBVc18～27则属于外源性多肽，说明某些与HLA-Ⅰ类分子具有亲和性的外源多肽无论来源于自身蛋白或是异种蛋白均有可能诱导出CTL反应，提示，在树突状细胞这样的“职业”抗原提呈细胞帮助下，自身多肽抗原可以打破机体的外周耐受状态而诱导CTL反应。这一方面扩大了肿瘤抗原肽的来源范围，另一方面提示在应用此类肽疫苗时应注意产生自身免疫反应的可能性。A201分子和A207分子在抗原肽结合部位仅有一个位置的氨基酸残基不同〔10〕，然而与A201分子结合的3个抗原肽只有1个多肽在自身树突状细胞提呈下诱导出了A207限制的CTL反应，其它两肽则未诱导成功，说明不同亚型Ⅰ类分子上个别氨基酸差异足以影响其提呈抗原肽的能力。考虑到北京人群A2亚型分布的广泛性，在选择使用肿瘤肽疫苗时，应首先进行HLA亚型的基因定型，以指导选择更有效的合成肽疫苗。特别要选择能够同时被A201和A207亚型分子所提呈的肽疫苗以增加适用范围。同时也提示在发展和应用肿瘤疫苗时，要尽可能选用自身系统。
志谢：本工作承蒙Judy Welsh女士制备A2亚型的PCR引物，高文红女士参加了本文的编辑工作。在此，深表感谢！
参考文献
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(收稿：1997-07-09 修回：1997-11-11)