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7株O139霍乱弧菌CT基因阴性菌的生物学性状研究

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第2期第19卷细菌学

作者：于纪桂　刘延清　祁国明　高守一　章丽娟

单位：102206 北京，中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所

关键词：霍乱弧菌；CT基因阴性菌株；免疫性

　　【摘要】　目的　拟从毒力基因ctx阴性的O139霍乱弧菌中筛选疫苗候选株。方法　用常规鉴定技术、Southern blotting技术和兔肠段结扎试验检测了7株霍乱肠毒素(CT)基因阴性的O139霍乱弧菌的一般特性、毒性和毒性基因；通过小肠免疫家兔，用PBL-ELISA 、ELISA和杀弧菌抗体试验评价抗原性；用家兔主动保护试验和乳鼠被动保护试验研究保护效果。结果　7株菌都具有O139霍乱弧菌的一般特性，均不引起肠段积液，毒力基因ctx、zot、ace和RS1探针杂交结果均为阴性。B13和94001免疫后0～28天血清抗体IgG效价一直上升，而94002免疫后14天最高；94002的血清杀弧菌抗体峰值最高。B13免疫家兔后可保护10⁵CFU毒株的攻击，94001和94002免疫后可保护10^5～7CFU毒株的攻击，94002加强免疫后能保护10⁷CFU毒株的攻击。B13免疫血清1∶4稀释后对乳鼠的保护率为20%，94001和94002的免疫血清1∶16稀释后的保护率为50%。结论　 7株O139霍乱弧菌属于毒力基因遗传单元缺失，无毒或毒性低，其中94002的免疫原性和保护效果较好，且初次免疫后存在免疫记忆。

　　Study on biological characteristics of seven ctx-negative Vibrio cholerae O139 strains　YU Jigui, LIU Yanqing, QI Guoming, et al. Priority Laboratory of Molecular Bacteriology of Ministry of Health Institute of Epidemiology and Microbiology Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 102206

　　【 Abstract 】　Objective　Vibrio cholerae O139, which was found in many countries and regions in the world in recent years, has been identified as the source of a cholera-like disease. So it is necessary to develop an effective vaccine for prevention of the epidemic. Seven Vibrio cholerae O139 strains whose ctx is negative were studied.Methods　The basic characteristics were detected with routine microbiology test and biochemical test, Southern blotting, and ligated rabbit ileal loop test. The immunogenicity was evaluated with vibriocidal antibodies test, ELISA and PBL-ELISA, and the protective efficacy with active protective test in rabbit model and passive protective test in infant mouse model.Results　All of the 7 strains had the general characteristics of Vibrio cholerae O139, were negative with ctx, zot, ace and RS1, and could not evoke ileal loop response after being administered to rabbits, The serum titers of IgG and vibriocidal antibody of rabbits, immunized with B13 and 94001 respectively, went up from day 0 to day 28, but with 94002, a peak appeared on the 14^th day, and its vibriocidal antibody titer was the highest among the 3 strains. The rabbits immunized with B13 were protected against the challenge of 10⁵ CFU virulent strains, those immunized with 10^5-7 CFU of 94001 or 94002, respectively, and those immunized and boosted with 94002,10⁷ CFU. In infant mouse model, to the strain B13, the immune serum diluted by 4-fold had 20% protective rate, to 94001 and 94002, diluted by 16-fold had 50% protective rate.Conclusions　The results prove that all of the 7 strains lack the whole virulence cassette and have little virulence. The strain 94002 exhibites not only the best immunogenicity and protective efficacy, but also immune memory.

　　【 Subject words 】　Vibrio cholerae　　ctx-negative strains　　Immunogenicity

　　O139霍乱弧菌是继O1血清群以后新近发现的又一群能引起流行性霍乱的致病性霍乱弧菌, 其影响曾波及世界上一些国家和地区^〔1〕, 对其进行研究以寻求有效的保护疫苗十分必要。霍乱肠毒素（CT）是引起霍乱腹泻的主要致病因子，在研制霍乱疫苗时，应首先考虑灭活CT基因。O139霍乱弧菌同样具有CT基因^〔2〕, 也通过CT致腹泻。因此，我们认为不产生CT的O139霍乱弧菌较安全，具有发展疫苗的潜在可能性。

　　为此，我们对本室筛选的7株O139 CT基因阴性菌株进行了生化特性、分子生物学特性、免疫原性以及保护作用的初步研究, 得到1株有望成为疫苗候选株的CT基因阴性菌株。本研究为进一步研究O139霍乱减毒活疫苗提供了一定的线索。

　　材料与方法

　　1. 菌株：实验用菌株见表1。

表1 实验用菌株特性及来源

　　Table 1.Source and characteristics of experimental strains

Strains	Serogroup and biotype	Genetic characteristics	Source
B2 B3 B4 B7 B13	O139	ctx^-zot^-ace^-RS1^-	Beijing
94001 94002	O139	ctx^-zot^-ace^-RS1^-	Xinjiang
93004 93005 93006	O139	ctx⁺	Xinjiang
MO45	O139	ctx⁺ zot⁺ ace⁺ RS1⁺	India
7743	O1 El Tor	ctx^-zot^-ace^-RS1^-	This lab
395	O1 Classical	ctx⁺ zot⁺ ace⁺ RS1⁺	CVD^*
Wujiang-2	O1 El Tor	ctx⁺ zot⁺ ace⁺ RS1⁺	NICPBP^**
81912	O1 El Tor	non-epidemic strain	Japan
169-68	O22

　　* in University of Maryland School of Medicine

　　**National Institute for Control of Pharmaceutical and Biological Products, PRC2. 实验动物：由本所动物室提供。新西兰家兔, 体重2～2.5kg, 合格证号为医动字第013063号；乳鼠, 5～ 6天龄, 合格证号为医动字第013557号。

　　3. 生物学性状：按文献〔3〕进行，细菌培养、革兰氏染色镜检和血清学鉴定，糖发酵试验、VP试验、甲基红试验、靛基质试验均按常规进行。菌株接种于产毒培养基^〔4〕, 37℃静止培养48小时, 按文献进行兔肠段结扎试验。

　　4. 遗传学性状

　　(1)染色体DNA 核酸内切酶图谱：内切酶购自华美生物工程公司；采用0.7%琼脂糖电泳，恒压，50v，20小时，EB染色。

　　(2) Southern 杂交分析：参照文献〔5〕。探针来源见表2, 探针用随机引物法标记, 地高辛非放射性探针标记试剂盒购自Boehringer Mannheim。

表2　实验用探针

　　Table 2.Experimental probes

Probe	Source	Length (bp)
ctx	PCR　　　primer 1　　5'-TCAGACGGGATTTGTTAGGCACG-3'	821
	primer 2　　5'-GCAGATCTTTAATTTGCCATAC-3'
ace	PCR　　　primer 1 　　 5' - TGCTTATGATGGACACCC - 3'	263
	primer 2　　5'- ACGGGTCATCAAAGCCTG - 3'
zot	Plasmid　　pBB241 (Dr.JB Kaper provide), MluI and DraIII digest	850
RS1	Plasmid　　pCT5A11 (Provide by Director Wang Bingrui, in Institute
	of Biology Products in Lanzhou), BglII digest	2　700

　　 5.免疫力保护力检测：免疫力和保护力实验结果均为2只或2只以上家兔结果均值。

　　(1)兔肠内免疫：取2kg 左右的健康家兔, 乙醚麻醉后, 无菌操作打开腹腔, 找到回盲部, 结扎, 然后在小肠上端注入1ml 10⁸CFU / ml的菌液, 缝合腹腔。于免疫前(0天), 免疫后第7天、14天、28天分别取血测抗体滴度动态变化。

　　(2)杀弧菌试验^〔3〕：血清56℃灭活半小时, 其余参照文献。指示菌为MO45。

　　(3) ELISA试验：菌体煮沸2小时, 配成10⁸菌/ml菌液, 作为包被抗原, 其余见参考文献〔3〕。

　　(4) PBL-ELISA试验^〔6〕：淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂(960411)；100μl淋巴细胞悬液（10⁶淋巴细胞/ml）取代ELISA试验中血清, 其余同ELISA。

　　(5)攻毒：将产毒菌株分离光滑菌落, 接种于产毒培养基^〔4〕，37℃静止培养48小时, 然后分别稀释至10^{5, 6, 7, 8, 9} CFU /ml 5个滴度, 对免疫后的家兔进行肠段结扎试验。

　　6.被动保护试验^〔7〕：将100LD₅₀的攻毒菌与不同稀释度的免疫血清混和, 37℃孵育半小时, 乳鼠灌胃，0.1ml /只, 观察48～72小时。

　　结　果

　　1. 一般特性：7株CT基因阴性菌株均为革兰氏阴性弧菌，特异性地与O139霍乱弧菌分型血清凝集(其中，94002有荚膜样O-抗原)。

　　2. 生化特性：7株均发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、可溶性淀粉和糊精，不发酵阿拉伯糖、卫茅醇、水杨素、木胶糖和肌醇，部分发酵半乳糖(除B7)和甘露糖(除B2、B3和B4)。霍乱红、靛基质和甲基红试验为阳性，VP试验只有B2、B3阳性。

　　3. 菌株兔肠段测毒结果：7株菌株按10^10～11CFU 注入兔肠段, 均无积液；阳性对照93005， 10⁶CFU注入肠段有明显积液(1.5ml/cm )；阴性对照生理盐水，无积液。见图1。

图1　O139 CT基因阴性菌株兔肠段测毒结果

　　Fig 1.Virulence study of the ctx-negative V.cholerae O139 strains by ligated rabbit ileal loops

　　4. 染色体DNA酶切图谱：从7株染色体DNA HindIII酶切图谱可见，7株菌的染色体酶谱不相同，B2和B3相似，这两株菌与另外5株CT基因阴性菌株和MO45的酶谱有明显差别；7株菌与O1及O22群霍乱菌株的酶切带型也有差别，特别是10kb以上的片段差别较大。见图2。

图2　染色体DNA酶切图谱

　　Fig 2.Restrictive map of chromosome DNA

　　1:B2; 2:B3; 3:B4; 4:B7; 5:B13; 6:94001;7:94002; 8:MO45; 9:395; 10:Wujiang-2;11:81912; 12:7743; 13:022; 14:λDNA/HindⅢ

　　5. Southern杂交分析：见图3。经HindⅢ酶切后, 与4种探针反应, 7株菌和阴性对照7743均为阴性, 阳性对照MO45、395和吴江-2为阳性。

图3　O139 CT基因阴性菌株Southern杂交分析结果

　　Fig 3.Southern blotting of the ctx-negative V.cholerae O139 strains

　　1：B2　2：B3　3：B4　4：B7　5：B13　6：94001　7：94002　8：MO45　9：395　10：Wujiang-2　11：7743　12：λDNA/HindⅢ

　　6. 血清ELISA效价：B13、94001和94002菌株免疫后兔血清IgG ELISA效价,以94002免疫血清IgG出现峰值较早, 14天效价最高；94001效价持续上升到28天；94002加强免疫后血清IgG效价迅速上升，第7天达到高峰。见图4。

图4　O139 CT基因阴性菌株免疫前后不同时期兔血清ELISA效价

　　Fig 4.Serum titers of the rabbits immunized with ctx-negative V.cholerae O139 strains

　　7.血清杀弧菌抗体滴度：28天之内以94002免疫血清效价最高，为1∶320。加强免疫后, 杀弧菌抗体滴度第7天(35天)达到最高。见图5。

图5　O139 CT基因阴性菌株免疫前后不同时期兔血清杀弧菌抗体滴度

　　Fig 5.Serum vibriocidal titers of the rabbits immunized with ctx-negative V.cholerae O139 strains

　　8.外周血淋巴细胞ELISA结果：3株菌免疫后反应相似,其IgG效价均在14天出现峰值(图6)。

图6　O139 CT基因阴性菌株免疫前后不同时期兔血PBL-ELISA效价

　　Fig 6.PBL-ELISA titers of the rabbits immunized with ctx-negative V.cholerae O139 strains

　　9. 家兔主动保护结果

　　(1)初次免疫后3株菌的排菌时间为9～12天，94002加强免疫后排菌时间为7～9天。

　　(2) B13免疫后能保护10⁵CFU毒株的攻击，94001和94002免疫后保护到10^5～7CFU, 94002加强免疫后保护到10⁷CFU。结果见表4，图7。

　　　　　　表3　O139 CT基因阴性菌株家兔主动保护试验结果

　　Table 3.Active protection of the rabbits immunized with ctx-negative V.cholerae O139 strains

Challenge strain	Ileal loop response (ml/cm)
Challenge strain	B13	94001	94002	94002 booster
93004　10⁹	1.40	1.62	1.16	0.75
10⁸	1.50	1.36	1.00	0.67
10⁷	1.58	1.17	0.46^*	0^*
10⁶	1.02	0.66	0.3^*	0^*
10⁵	0^*	0.37^*	0.20^*	0^*
93005　10⁹	1.38	1.64	1.03	0.60
10⁸	1.10	1.27	1.11	0.55
10⁷	1.25	0.31^*	0.72	0^*
10⁶	0.75	0.25^*	0^*	0^*
10⁵	0^*	0.06^*	0^*	0^*
93006　10⁹	1.70	1.46	1.40	0.55
10⁸	1.48	1.48	0.96	0.58
10⁷	1.25	0.60	0.54	0.46^*
10⁶	0.90	0.30^*	0.04^*	0.18^*
10⁵	0.10^*	0.12^*	0^*	0.20^*
Positive control^**	1.48	1.44	1.44	0.69
Negative control^**	0	0	0	0

　　Note: 1.The results of B13, 94001 and 94002 booster are the mean value of two rabbits,the result of 94002 is the mean value of four rabbits;

　　* The ileal loop response is negative based on the standard (≤0.5ml/cm);

　　** Positive control: 93005, 10¹¹CFU; Negative control: toxin-producing medium

图7　O139 CT基因阴性菌株家兔主动保护试验结果

　　Fig 7.Active protection of the rabbits immunized with ctx-negative V.cholerae O139 strains

　　1:93004 10⁹，2:93004 10⁸，3:93004 10⁷，4:93004 10⁶，5:93004 10⁵，6:93005 10⁹，7:93005 10⁸，8:93005 10⁷，9:93005 10⁶，10:93005 10⁵，11:93006 10⁹，12:93006 10⁸，13:93006 10⁷，14:93006 10⁶ ，15:93006 10⁵ ，16:93005 10¹¹，17:Toxin-producing medium

　　10. 乳鼠被动保护试验结果：B13免疫血清1∶4稀释保护率仅为20%，而94001、94002免疫血清可达(90～100)%。1∶16稀释保护率仍为50%。

　　讨　论

　　我们通过Southern杂交分析和兔肠段结扎测毒试验, 证实7株O139菌株均为CT基因阴性菌株。根据以往的研究,选择了B13、94001、94002等3株菌进行家兔主动免疫保护试验,经肠一次免疫,28天后攻毒, 结果显示94001和94002保护效果比B13好, 而以94002为最好,能保护10^6～7CFU毒株的攻击。28天的免疫血清被动保护试验, 94001和94002也比B13好,主动保护和被动保护试验的结果94002效果较好。B13和94001免疫血清ELISA效价及杀弧菌抗体滴度从0～28天一直呈上升趋势, 而94002则是14天最高, 28天已经下降。28天之内，94002的杀弧菌抗体滴度最高, 为1∶320 。杀弧菌抗体能反映机体抵抗霍乱弧菌定居和致病的能力, 与霍乱弧菌感染引起腹泻的危险性密切相关^〔8,9〕。外周血淋巴细胞ELISA检测结果, 3株菌免疫后反应一致, 都能产生一定的免疫反应。

　　O139菌株的免疫学反应在一月之内有差异，主动保护效果较好的94002免疫后28天血清ELISA效价、杀弧菌抗体滴度均下降。因此, 我们对94002进行加强免疫，发现其血清ELISA效价、杀弧菌抗体滴度和PBL-ELISA效价在加强免疫后又迅速上升,7天达高峰,然后很快下降；排菌时间也由9～11天降为7～9天，说明免疫后的家兔在遇到相同抗原时，能迅速产生免疫回忆反应和保护作用；另外，94002加强免疫后主动保护作用比一次免疫效果更好, 能保护毒株10⁷CFU 攻击。其免疫原性值得进一步研究。

　　本文工作受“863”项目基金资助，资助号码102-04-01

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(收稿：1997-09-24　　修回：1998-06-25)

作者：风清扬 2009-2-21