异种输血对大鼠内脏功能的影响

异种输血对大鼠内脏功能的影响

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 基础免疫学

作者：杜成友　姚榛祥　董蒲江　曹友德

单位：杜成友　姚榛祥（400016　重庆医科大学临床学院普外科）；董蒲江（器官移植研究室）；曹友德（病理科）

关键词：异种；输血；大鼠；内脏功能

　　【 摘要 】　目的　观测静脉输注人、猪、豚鼠全血对大鼠存活及内脏功能的影响，为今后研究供体特异性输血诱导异种免疫耐受奠定基础。方法　大鼠阴茎背静脉输注人、猪、豚鼠全血，每只大鼠每天1ml。输人血的45只大鼠平均分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，其相应输血总量分别为1ml，6ml，10ml，观察大鼠一般情况，存活率，并在输血后第10天，第60天分别处死7只、8只，行PaO₂、PaCO₂、A-aDO₂、GPT、GOT、TP、LDH、Cr、BUN以及心、肝、肾、肺、脾脏、胃、血管病理形态检查。输注猪、豚鼠血大鼠仅观察一般情况，存活率。结果　输注人、猪、豚鼠血大鼠精神好，全部存活。输人血前及输血后第10天，第60天大鼠组及各组间PaO₂、PaCO₂、A-aDO₂、GPT、GOT、TP、LDH、Cr、BUN比较差异无显著性(P＞0.05)。心、肝、肺、肾、脾、胃、血管病理检查无异常发现。结论　大鼠接受异种全血静脉输注不会损伤大鼠内脏功能。

　　Effect of xenogenic blood transfusion on visceral functions of rats　DU Chengyou, YAO Zhenxiang, DONG Pujiang, et al. Department of General Surgery, College of Clinical Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016

　　【 Abstract 】　Objective　In order to demonstrate whether donor-specific blood transfusion induces tolerance in murine xenografting.Methods　We first studied effect of xenogenic blood transfusion on visceral functions of rats. In this study, human, pig and guinea pig were used as blood donors and the outbred wistar rats as the recipients. Forty five recipient rats transfused with human blood were randomly divided into group Ⅰ,Ⅱand Ⅲ. The total human blood volume for group Ⅰ，ⅡandⅢ were 1ml, 6ml and 10ml, respectively. One ml blood in volume was adminstered to one rat via the vein each day and the rat survival， the serum values of PaO₂， PaCO₂， A-aDO₂， GPT，GOT，TP， LDH，BUN and Cr as well as the pathological changes of heart，liver，lung，kidney，spleen，stomach and the vascularity of the rats before and after human blood transfusion were evaluated；whereas the rats transfused with pig and guinea pig blood were used for observing their survivals only.Results　All rats survived well after transfusion with human. Pig and guinea pig blood, there were no statistical difference about both the serum values of PaO₂, PaCO₂, A-aDO₂, GPT, GOT, TP, LDH, Cr, BUN(P＞0.05) and the pathological changes of heart, liver, kidney, lung, spleen, vascularity, stomach of the rats before and after human blood transfusion.Conclusions　These results indicated that xenogenic blood transfusion did not affect rat survival and visceral functions and could be used to study xenogenic tolerance induction in murine xenotransplantation.

　　【 Subject words 】　Xenogenic blood transfusion　　Rat　　Visceral function

　　本实验探讨人、猪、豚鼠全血静脉输注给大鼠对其内脏功能的影响。其目的在于进一步研究异种移植排斥反应和免疫耐受的诱导。

　　材料与方法

　　1.动物：雄性Wistar大鼠，体重150～250g，共65只，为受血者；健康豚鼠，体重250～300g，共15只及本地杂种猪10只，为供血者，以上动物由重庆医科大学动物中心提供。人体全血取自45名健康献血者。

　　2.异种全血的制备、保存

　　豚鼠全血制备：3％戊巴比妥钠(30mg·kg^-1)腹腔注射麻醉，腹部备皮，消毒，大“十”字切口入腹，显露腹主动脉，远心端阻断，近心端插管固定，一次空针抽取全血10ml，放入盛装2.5ml ACD液的无菌消毒瓶中，轻轻混均，即送入冰箱(4℃～6℃)保存备用。

　　猪全血制备：无菌抽取猪股动脉血10ml，置入盛装2.5ml ACD液的无菌消毒瓶，轻轻混均，即送入冰箱(4℃～6℃)保存。

　　人全血制备、保存：取自45个献血者1ml，6ml，10ml全血,分别置入盛装ACD液0.25ml，1.5ml，2.5ml的无菌瓶中，1ml组即静脉注射，6ml及10ml组分送冰箱(4℃～6℃)保存。

　　3.输血：Wistar大鼠乙醚吸入麻醉，每天每只Wistar大鼠经阴茎背静脉输异种血1ml。每只大鼠均接受同一供体血。麻醉苏醒后回笼饲养，每隔10天称体重。

　　4.实验分组：见表1。

　　表1　实验分组(表内n为鼠数)

　　Table 1. The experimental groups(n in the brackets is rat's number)

Donor	Blood volumes	Group(n)
Human blood	1ml	Ⅰ(15)
	6ml	Ⅱ(15)
	10ml	Ⅲ(15)
Pig blood	10ml	Ⅳ(10)
Guinea pig blood	10ml	Ⅴ(10)

　　Notes：Every rat has been transfused with 1ml blood each day The rats were sacrificed to evaluate the data about the PaCO₂, PaO₂, A-aDO₂, gPT, GOT,TP,BUN,Cr and the pathological changes of heart, liver, lung,kidney, spleen, vascularity, stomach before transfusion and on 10th day(n=7), 60th day(n=8) after transfusion.The rats in group Ⅳ，Ⅴ were used for observing their survials only5.检测指标：

　　(1)异种交叉配血。

　　(2)各组大鼠一般情况及存活率。

　　(3)动脉血气：检测动脉血氧分压(PaO₂)，动脉血二氧化碳分压(PaCO₂)，并计算肺泡-动脉血氧分压差(A-aDO₂)。

　　(4)血清生化：观测谷丙、谷草转氨酶(GPT、GOT),总胆红素(TB),尿素氮(BUN),肌酐(Cr)，乳酸脱氢酶(LDH)。

　　(5)病理形态学观察：处死动物过程中取右肺、右肝、右肾、心脏、胃窦、大血管及脾脏作光镜常规病理切片和电镜超薄切片。

　　 6.统计学处理：实验数据均以x±s表示，同组动物输血前、后数据的比较用配对t检验，两组间数据的比较采用不配对的t检验。

　　结　果

　　1.交叉配血：包括主试验和副试验。①主试验为受血者血清＋供血者红细胞悬液；②副试验为供血者血清＋受血者红细胞悬液。输血前交叉配血结果见表2。

　　表2　交叉配血结果(玻片法)

　　Table 2.Results of xenogenic blood cross-matching

Donors	Constituent	Rat
		Serum	Erythrocyte
Human	Sera	-	++++
	Erythrocyte	±	-
Pig	Sera	-	++++
	Erythrocyte	±	-
Guinea pig	Sera	-	++++
	Erythrocyte	±	-

　　 2.各组大鼠一般情况及存活率：各组大鼠输血后均进食，精神好，第60天各组大鼠体重较输血前有增加。输血后第10天、第60天各组大鼠均全部存活。

　　3.动脉血气：输人血组大鼠输血前、后第10天、第60天组内及组间PaO₂、PaCO₂、A-aDO₂相互比较差异无显著性，其结果见表3。

　　　　　　　　表3　PaO₂、PaCO₂、A-aDO₂的变化(KPa，x±s)

　　Table 3.Data about the PaO₂、PaCO₂、A-aDO₂ in the rats before　and after human blood transfusion

Parameter	Group	Before transfusion	After transfusion
			10th day	60th day
PaCO2	Ⅰ	13.4±0.2	13.1±0.3	13.3±0.2
	Ⅱ	13.2±0.3	13.3±0.4	13.5±0.4
	Ⅲ	13.6±0.6	13.5±0.4	13.4±0.2
PaCO2	Ⅰ	4.3±0.3	4.2±0.3	4.3±0.3
	Ⅱ	4.2±0.2	4.3±0.5	4.4±0.3
	Ⅲ	4.4±0.3	4.3±0.4	4.3±0.5
A-aDO2	Ⅰ	2.3±0.2	2.5±0.3	2.5±0.3
	Ⅱ	2.2±0.1	2.4±0.5	2.2±0.3
	Ⅲ	2.4±0.2	2.2±0.3	2.4±0.3

　　Note: Groups before transfusion compared with those after transfusion,P＞0.05, group Ⅰ compared with group Ⅱ, group Ⅱ compared with group Ⅲ,group Ⅲ compared with group Ⅰ, P＞0.05.4.输入血前及输后第10天、第60天各组及组间GPT、GOT、TB、BUN、Cr、LDH值比较差异无显著性，实验后的变化见表4。

　　　　　　　　　表4　GPT、GOT、BUN、Cr、TB、LDH的变化(x±s)

　　Table 4. Data about the GPT,GOT,BUN,Cr,TB,LDH in the rats before and after human blood transfusion

Parameter	Group	Before transfusion	After transfusion
			10th day	60th day
GPT U/L	Ⅰ	16.5±3.5	15.4±2.2	16.8±3.5
	Ⅱ	15.4±4.8	16.2±3.8	15.8±4.2
	Ⅲ	16.2±4.1	15.9±4.2	16.1±4.1
GOT U/L	Ⅰ	18.4±3.4	17.6±3.1	17.9±4.8
	Ⅱ	17.6±2.9	17.9±3.8	18.2±3.8
	Ⅲ	19.2±3.7	18.6±3.7	18.2±4.2
BUN mg/dl	Ⅰ	26.5±4.7	24.2±3.8	27.5±4.4
	Ⅱ	24.5±3.8	25.7±3.9	26.2±4.1
	Ⅲ	27.5±5.6	28.2±4.5	26.8±3.9
Cr mg/dl	Ⅰ	2.1±0.3	1.9±0.2	2.2±0.4
	Ⅱ	1.9±0.2	2.1±0.3	2.0±0.3
	Ⅲ	2.3±0.4	2.2±0.2	2.1±0.2
TB mg/dl	Ⅰ	0.68±0.04	0.71±0.06	0.72±0.04
	Ⅱ	0.72±0.03	0.69±0.04	0.68±0.03
	Ⅲ	0.73±0.05	0.68±0.04	0.72±0.05
LDH U/L	Ⅰ	147.2±15.6	152.6±18.4	148.7±13.9
	Ⅱ	143.5±14.7	156.4±19.4	152.8±14.4
	Ⅲ	150.5±16.7	150.8±15.7	149.7±14.7

　　Note: Groups before transfusion compared with those after transfusion, P＞0.05，group Ⅰ compared with group Ⅱ, group Ⅱ compared with group Ⅲ,group Ⅲ compared with group Ⅰ, P＞0.055.病理形态学：输人血前及输后第10天，第60天大鼠肝、肾、脾、心脏、胃、血管呈相似的病理改变。(1)肝脏：肝血窦、中央静脉无充血，肝细胞结构完整，无变性坏死，枯否氏细胞增生不明显，汇管区无明显炎症细胞浸润；(2)肾脏：肾小球内毛细血管轻度充血，无血栓形成，肾间质无水肿，无炎性细胞浸润；(3)肺脏：肺泡间膈轻度增厚，毛细血管轻度扩张、充血，少量淋巴单核细胞浸润，肺泡腔内无渗出物；(4)血管：内皮完整，内膜无增厚，无坏死损伤；(5)胃：胃粘膜上皮完整，核极性存在，无灶性糜烂、出血、坏死；(6)心脏：心肌结构正常，无间质出血，微小血管内无血栓形成，未见炎性细胞浸润；(7)脾脏：光镜检查可见脾小体无增生，脾髓血窦无扩张，中央动脉管壁无增厚，无洋葱皮样改变。

　　电镜显示：(1)肝脏：肝细胞内各细胞器分布结构均正常，肝血窦毛细管内皮正常，Dissc间隙无胶原堆集，肝糖元分布正常，未见免疫复合物沉积。(2)肾脏：肾小球毛细血管正常，基底膜未见电子致密的免疫复合物沉积，足细胞形态正常，未见足突融合现象。(3)肺：肺泡气-血屏障结构正常，基底膜未见增厚，无电子致密沉积，肺泡Ⅰ型上皮正常，Ⅱ型上皮细胞也正常。(4)血管：血管内皮细胞连续、完整，无明显超微结构改变。(5)胃：胃腺各细胞成分正常，主细胞、壁细胞细胞核、细胞成份未见病理变化，酶原颗粒形态数目正常。(6)心脏：心肌细胞呈正常形态学表现，核、线粒体、肌浆网，粗、细肌丝，以及润盘形态正常，未见病理改变。(7)脾：脾内除部分细胞线粒体肿胀外，其它细胞分化、结构均正常。

　　讨　论

　　人类研究输血已有百年历史，早已明确不同种属个体之间，同种异体血型不合个体是不能输血的。因而异种输血对异种器官存活的影响及异种输血诱导免疫耐受的研究报道甚少^〔1〕。我们的实验结果表明，哺乳类动物不同种属交叉合血主、副试验均出现快速凝集反应，它们之间不能彼此作献血者；当大鼠红细胞与人、猪及豚鼠血清混合时，出现快速凝集，表明哺乳类动物接受大鼠血液后会出现溶血反应。然而，当豚鼠及其它哺乳类动物分别与大鼠血清混合时仅出现缓慢的弱凝集反应，将人、猪和豚鼠全血分别静脉输注大鼠，输血量分别达大鼠总血量的10％，60％和90％时，所有大鼠均长期存活，未出现溶血反应。

　　大鼠输入人全血前及输后第10天，第60天的PaO₂、PaCO₂、A-aDO₂、GPT、GOT、LDH、TB、Cr、BUN之间差异无显著性(P＞0.05)。输血前及输后10天，60天大鼠心、肝、肺、肾、脾、血管、胃光镜电镜检查也未见明显的病理改变，这有助于解释输异种血后大鼠精神，进食好，输血后60天大鼠体重均有增加。

　　大鼠输注异种全血未出现溶血反应，是否由于物种进化而导致大鼠调控体液免疫应答的部分基因缺陷所致，是一个令人感兴趣的问题。今后若能弄清调控人、猪血细胞表面抗原的基因，通过基因工程就有可能将人血细胞表面抗原表达于猪血细胞上，使猪血“更像”人血，将猪血输给人后就有可能避免溶血反应的发生。

　　Nardo等在研究仓鼠-大鼠(concordant异种移植)心脏移植时发现仅特异性输注供体全血导致超急性排斥反应， 然而加用FK506（1mg^.kg^-1.d^-1）却延长了仓鼠心脏移植于大鼠的存活时间，较单纯应用FK506为佳^〔1〕。Dono等联合雷帕霉素(Rapamycin)，抗淋巴细胞血清和供者脾细胞胸腺注射，显著延长小鼠-大鼠移植皮肤的存活时间^〔2〕。这说明异种器官、皮肤移植之前联合应用供体抗原和新型免疫抑制剂，能诱导异种移植耐受。因此，尽管目前临床异种输血受到限制，我们仍有理由相信随着新型免疫抑制剂和转基因动物的研究，异种输血也有可能像同种异体输血一样，有益于异种移植物的存活，并进而揭示异种移植排斥反应，免疫耐受诱导的某些机制。

　　总之，我们的实验说明大鼠接受异种输血是安全的，异种血液抗原可经静脉进入大鼠循环系统。目前我们正对大鼠输异种全血未出现溶血反应的原因及异种输血对大鼠细胞、体液免疫系统的作用进行研究，其结果可能有助于部分了解异种细胞移植排斥反应机理和异种移植免疫耐受的研究。

　　参考文献

　　[1]Nardo B, Valdiva LA, Pan F, et al. Pretransplant xenogeneic blood transfusion combined with FK506 prolongs hamster-to-rat liver xenograft survival.Transplant Proc,1994,26(3)∶1208.

　　[2]Dono K, Valdivia A, Symer DE,et al.Marked prolongation of rat skin xenografts induced by intrathymic injection of xenogeneic splenocytes and a short course of rapamycin in antilymphocyte serum-treated mice.Transplantation, 1995,59∶929-938.

(收稿：1997-11-28　　修回：1998-04-13)