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用DNA分型研究中国人HLA-A,-C,-B的部分单倍型
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第2期第19卷 HLA
作者：林琳 高小江 祝文华 张新根 郭玉红 刘雅琴 李建平 徐林敏 徐岳康 孙逸平
单位：林琳 张新根 郭玉红 刘雅琴 徐林敏（100045 北京市儿科研究所免疫遗传室）；祝文华 李建平 徐岳康（安徽省医科大学遗传中心）；高小江（澳大利亚国立大学人类基因室）；孙逸平（中日友好医院）
关键词：HLA抗原；DNA/分析；系谱
【 摘要 】 目的 对HLA-Ⅰ类基因同时进行DNA基因分型和血清学分型，比较血清学分型的误差及改良的可能性; 实测我国华东地区1个相对隔离人群的HLA-A-C-B单倍型的种类和特点，评估它们的意义。方法 对安徽省一个相对隔离人群的两个大家系三代14个小家庭中共83人用血清学分型和DNA基因分型两种方法进行HLA-A-C-B三座位的分型。根据遗传分离定律演绎出它们的单倍型并进行分析。结果 发现血清学方法的总误差率达17.2%;但我们认为血清学分型仍有相当大的改进余地。基因分型共检出HLA-A基因12种，B基因19种，C基因11种；三座位单倍型共35种；发现HLA-B-C之间的连锁不平衡远大于A-C之间；分析判定了3种祖先单倍型；指出遗传漂变的存在对本人群单倍型的非随机性有重要的影响。结论 使用本文的研究方法以及获得的结果可为不同地区隔离人群的同类研究提供经验和进行比较。
A study on HLA-A-C-B haplotype in Chinese with DNA typing LIN lin*, GAO Xiaojiang, ZHU Wenhua, et al. * Beijing Pediatric Institute, Beijing Children's Hospital, Beijing 100045
【 Abstract 】 Objective To compare the results from serology to DNA gene typing method, and by analysing the real HLA-A-C-B haplotype to evaluate their significance.Methods Two large clans with 14 small families total 83 individuals in an isolated village in Anhui province were HLA typed using both serology and DNA methods. Haplotypes were deduced according to the genetic segregation.Results The results showed that the total error appeared in serology was 17.2% in comparison with DNA typing. This error could be partly corrected by reassignment in accordance with DNA typing. Twelve alleles were identified in HLA-A locus, 19 in B locus, and 11 in C locus. Thirty five haplotypes were found. The linkage disequilibrium in HLA-C-B loci was greater than in A-C. Three ancestor haplotypes were indentified.Conclusions The existence of genetic drift may be the major factor in contribution of the haplotype differentiation in this isolated population.
【 Subject words 】 HLA antigens DNA/analysis Pedigree
对HLA的研究在我国从七十年代算起已经有了二十多年的历史，但至今对HLA-Ⅰ类基因的分型仍主要依靠血清学，定型误差较大；另外HLA-C位点的抗原（基因）从未正确定型过；再由于家系研究的欠缺，对中国人Class Ⅰ单倍型特征也不甚清楚，大多数是根据连锁不平衡参数演绎的HLA-A、B二座位的单倍型；家系资料的欠缺也使获得中国人HLA纯合子细胞显得困难。为进一步研究中国人HLA-Ⅰ类基因单倍型，我们利用第十二次组织相容性国际会议（1996年巴黎）和第五次HLA亚大会议（1995年，曼谷）的机会，通过国际合作对安徽宿松县境内一个相对隔离的人群的两个三代以上的大家庭，分别用血清学和DNA分型方法进行了HLA Class Ⅰ分型。在这个研究中，血清学分型在国内完成，DNA分型在澳大利亚国立大学人类医学实验室完成。本文重点分析获得的结果。
材料和方法
1.研究对象：居住在邻近湖北边界的安徽省宿松县扬山乡的的两个大家系。此地因地理环境和生活条件较差而造成相对隔离状态，多近亲婚姻，属于大家系的各个小家庭14家共83人。
2.HLA分型方法
血清学分型：采用国际标准微量淋巴细胞毒方法。标准血清盘由中日友好医院临床医学研究所提供，补体为本室自制。
DNA/SSOP分型：取受测对象静脉血液3ml，EDTA抗凝，用饱和醋酸钠盐法制备基因组 DNA〔1〕。采用PCR/SSOP方法分型，扩增条件、引物 、探针序列和杂交条件见文献〔2～4〕。
3.统计分析：用直接计数法计算单倍型。
结果和讨论
1.血清学和DNA分型方法的比较：借助DNA分型法,在包括二大家系的83名人群中几乎检出了全部的HLA-Ⅰ类等位基因而未留有空白。但血清学方法检测结果不佳，无法利用血清学分型结果分析单倍型。关于亚型，表1列出了用DNA法和血清学法分别检出的基因和抗原频率，以及血清学特异性经过校正以后再指定的检出数。从中可以看出：
表1 HLA血清学检测的误差
Table 1. The error of serology method(The figure in this table is the alleles identified)
| Gene DNA | Serology | Corrected | |
| A2 | 51 | 47 | 49 |
| A*0201 | 10 | 0 | 0 |
| A*0203 | 11 | 0 | 0 |
| A*0206 | 9 | 0 | 0 |
| A*0207 | 19 | 0 | 0 |
| A*0210 | 2 | 0 | 0 |
| A3 | 3 | 3 | 3 |
| A*0301 | 3 | 0 | 0 |
| A9 | 24 | 23 | 23 |
| A*2401 | 4 | 0 | 0 |
| A*2402 | 20 | 0 | 0 |
| A10 | 16 | 13 | 13 |
| A*2601 | 16 | 0 | 13 |
| A11 | 43 | 39 | 43 |
| A*1101 | 43 | 0 | 43 |
| A19 | 21 | 3 | 6 |
| A*3101 | 3 | 0 | 3 |
| A*3303 | 18 | 0 | 0 |
| B5 | 7 | 7 | 7 |
| B*0501 | 7 | 0 | 0 |
| B12 | 3 | 3 | 3 |
| B*4402 | 3 | 0 | 0 |
| B13 | 11 | 10 | 11 |
| B*1301 | 11 | 0 | 0 |
| B15 | 6 | 6 | 6 |
| B*1501 | 4 | 0 | 4 |
| B*1502 | 1 | 0 | 0 |
| B*1511 | 1 | 0 | 0 |
| B16 | 25 | 24 | 25 |
| B*3901 | 22 | 0 | 22 |
| B*3802 | 3 | 0 | 3 |
| B17 | 11 | 2 | 4 |
| B*5801 | 9 | 0 | 0 |
| B*5802 | 2 | 0 | 0 |
| B22 | 16 | 13 | 15 |
| B*5401 | 7 | 0 | 0 |
| B*5501 | 1 | 0 | 0 |
| B*5502 | 8 | 0 | 0 |
| B27 | 11 | 11 | 11 |
| B*2704 | 11 | 0 | 11 |
| B35 | 1 | 0 | 1 |
| B*3502 | 1 | 0 | 0 |
| B40 | 37 | 32 | 34 |
| B*4001 | 35 | 0 | 0 |
| B*4002 | 2 | 0 | 0 |
| B46 | 26 | 22 | 23 |
| B*4601 | 26 | 0 | 0 |
| B48 | 2 | 2 | 2 |
| B*4801 | 2 | 0 | 0 |
*This table shows that the allele number identified using DNA typing method was much more than that from serology method. Corrected means reassignment after the specificity of typing sera be corrected by DNA typed alleles.(1)DNA法共检出12种HLA-A等位基因，HLA-B 19种，HLA-C 11种。血清学方法基本上未能检出亚型，而HLA-C基因产物历来是很难用血清学方法正确定型的。因此依靠血清学不可能分析出精确的包括亚型的HLA-A-C-B单倍型，在本文之前尚未有对中国人的此类实测的单倍型报道。
(2)由于DNA的精确分型使本研究获得了参照系统，证实血清学方法的总误差达17.2%。说明现条件下血清学分型的不可靠性。而经过校正的血清学检测结果误差下降至11.2%，并可区分B*1301，B*1501和B*3901等亚型。在这里值得注意两点：①说明在国内研制HLA-Ⅰ类分型血清时,有必要用DNA分型技术鉴定标准细胞；②用这个方法可进一步深入研究中国人群中到底有多少HLA亚型可借助血清学测出其特异性。换言之，即哪些基因亚型的产物具有抗原性。这对于器官和骨髓移植时判别哪些亚型的不配合会引起严重的排斥反应是重要的。根据1997年WHO对HLA的命名，用血清学可以分出的HLA-A型别为18/83（DNA分型数），B位点为31/186，抗原型别远低于等位基因型别。但是根据我们对血清学研究中所发现的每一血清样本的复杂反应格局，从理论上可以认定已客观地反映出不同HLA分子的表位（epitope)。在以DNA分型作为标准的基础上进一步研究血清学的特异性，就有可能进一步提高血清学的分辨率，从而鉴定出某些亚型。因此，即便在某些商业化单抗分型板质量日益提高的情况下，研究中国人特定的HLA抗原型别，抗血清仍不能被轻易替代。
2.单倍型：本研究的单倍型全由实测产生，在四代人的分离中验证了它的正确性。由于是两个大
家系的非随机人群，因此并不反映当地的真正频率。但如果将二家第一代10人的单倍型视为祖先单倍型，则仅有A*0203-C*0304-B*4001、A*3303-C*0102-B*5401、A*0203-C*0304-B*1301 、A*0207-C*0102-B*4601 、 A*2401-C*0304-B*4001、A*1101-C*0702-B*3901 、A*1101-B*1501、A*1101-C*0303-B*5502、A*1101-C*0702-B*4001、A*2601-C*0602-B*5101、A*2402-C*0702-B*5501、A*2402-C*0702-B*4001、A*2601-C*0702-B*3901等13种，而其余的22种单倍型都是在 24次随机婚配中来源于女方（因女儿多嫁出外村，未测）。故该结果反映出一定程度的随机性，而具有一定的代表性。
(1)发现HLA-C，-B间强连锁不平衡。表2是测出的全部35条单倍型，如分别比较其中A、B座位的连锁强度，结果见表3。
表2 A-C-B单倍型的检出数
Table 2. The number of HLA-A-C-B haplotypes (n=83)
| A | C | B | n |
| 2401 | 0101 | 1501 | 1 |
| 3303 | 0102 | 5401 | 4 |
| 2402 | 0102 | 5502 | 3 |
| 0206 | 0102 | 4601 | 3 |
| 0207 | 0102 | 4601 | 20 |
| 2402 | 0102 | 4601 | 2 |
| 1101 | 0102 | 4601 | 2 |
| 0210 | 03 | 1501 | 2 |
| 3303 | 0302 | 5801 | 17 |
| 1101 | 0303 | 5502 | 7 |
| 2402 | 0303 | 4002 | 3 |
| 0206 | 0303 | 4601 | 3 |
| 0203 | 0304 | 1301 | 6 |
| 1101 | 0304 | 1301 | 6 |
| 0203 | 0304 | 4001 | 5 |
| 0206 | 0304 | 4001 | 6 |
| 2401 | 0304 | 4001 | 6 |
| 1101 | 0304 | 4001 | 2 |
| 0201 | 0304 | 4801 | 2 |
| 0301 | 0501 | 4402 | 3 |
| 1101 | 0501 | 5401 | 1 |
| 0207 | 0601 | 1502 | 2 |
| 2601 | 0602 | 5101 | 2 |
| 2601 | 0702 | 3901 | 21 |
| 1101 | 0702 | 3901 | 10 |
| 2402 | 0702 | 5401 | 2 |
| 2401 | 0702 | 5501 | 1 |
| 0203 | 0702 | 3502 | 1 |
| 2402 | 0702 | 4001 | 16 |
| 1101 | 0702 | 4001 | 11 |
| 0201 | 1202 | 2704 | 6 |
| 1101 | 1202 | 2704 | 5 |
| 0206 | 1401 | 5101 | 1 |
| 0201 | 1502 | 5101 | 2 |
| 3101 | 1502 | 5101 | 4 |
表3 C座位基因和B、A两座位基因的连锁情况
Table 3.The linkage pattern of HLA-C gene with HLA-B and A locus
| C locus gene | Number of genes
linked with B locus |
Number of genes
linked with A locus |
| 0101 | 1 | 1 |
| 0102 | 3 | 5 |
| 0302 | 1 | 1 |
| 0303 | 3 | 3 |
| 0304 | 3 | 6 |
| 0501 | 2 | 2 |
| 0601 | 2 | 2 |
| 0702 | 5 | 7 |
| 1202 | 1 | 2 |
| 1401 | 1 | 1 |
| 1502 | 1 | 2 |
从表3可见,与同一个C基因连锁的HLA-A基因较B基因分散，在HLA-C*0102、0304、0702、1202、1502等型中均反映这种规律性。这种C-B座位更强的连锁不平衡是最近二、三年内发现的现象。我们首次在大陆中国人群中得以证实。这一现象产生的原因可能有三：①C-B间距离较A-C间短〔5〕；②A-C间存在某些交换热点；③C座位在进化上出现较晚，而实际上从基因座位图中可以看到C-B之间距离确实较A-C为短。
(2)祖先单倍型：在进化过程中，HLA多态性是逐步增加的。那些原始的单倍型称为祖先单倍型。在本研究中值得指出的祖先单倍型有3条：
1）A*3303-C*0302-B*5801共发现17例，仅有1个例外为A*3303-C*0102-B*5401。前者显然是1条祖先单倍型，由于发生了A-C交换而形成了后者，其历史较短。这一条祖先单倍型也存在于其他人种〔6〕，强连锁不平衡说明其保守性。
2）27例B*4601和C*0102连锁，仅3人与C*0303连锁。如联系A座位，A*0207-C*0102-B*4601占20/30，其显然为一祖先单倍型，而且提示A-C交换比B-C交换强。
3）12例B*1301-C*0304单倍型中的A基因值得一提。根据我们在北方地区利用血清学技术进行的家系研究，曾报道B13和A30、Cw6有强连锁〔7，8〕。现进一步证明B13在中国人群中有两个亚型：即B*1301和B*1302。与A30连锁者主要为B*1302，主要分布于北方人，而B*1301并不与A30连锁，多分布于我国南方人。
本研究在24 次减数分裂中未发现A-C或C-B位点之间的交换。这说明HLA的单倍型是相当保守的。
本研究中发现2种3例纯合子，其单倍型分别为A*3303-C*0302-B*5801和A*0207-C*0102-B*4601。他们均来自家系以外的女性，可见此人群由于相对隔离，从而造成单倍型型别较单调。众所周知，纯合子在HLA研究中具有重要意义，至少在器官移植和血小板输血时进行PRA交叉配型中，有特殊的实际应用价值。
在每个小家庭的单倍型垂直传递过程中，可以发现由于机遇而造成的单倍型传递的非随机性。从理论上计算，第二代继承的概率为1/2，第三代继承的概率为1/4，然而个别的单倍型在三代中的传递概率达到1（每代均传），而个别单倍型又低至0（丢失），出现了典型的遗传漂变（drift)现象。这是该人群中某些单倍型偏离随机人群甚大的原因之一，说明了此人群的隔离性。由于相对隔离，此人群可为进一步研究某些疾病易感基因提供良好的参照系。参考文献
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(收稿：1998-02-05 修回：1998-05-16)