点击显示 收起
用16S rRNA探针定量测定普氏立克次体在细胞内的繁殖量
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第2期第19卷 立克次氏体
作者：胡福泉 金晓琳 刘启富 俞树荣
单位：400038 重庆，第三军医大学微生物学教研室
关键词：立克次体；普氏；核糖核酸酶类；RNA探针
【 摘要 】 目的 以普氏立克次体为研究对象，建立一种定量测定胞内微生物繁殖的方法。方法 从立克次体感染细胞提取总RNA为样品或用硫氰酸胍裂解感染细胞，以裂解物为样品，用32P标记的16S rRNA特异探针做RNA酶保护分析。 根据探针分子结合数，计算出检测到的靶序列分子数，反映胞内微生物的繁殖量。 结果 从0.5μl直接裂解物可检测到3.94×104个16S rRNA分子；从6pg的总RNA中可检测到5.82×104个16S rRNA分子。用本法试测立克次体在宿主细胞内的生长曲线，只表现出迟缓期及对数生长期，而无稳定期及衰退期。 结论 用特异性探针通过RNA酶保护分析法可以定量测定胞内微生物在宿主细胞内的繁殖量。由本法测定到的普氏立克次体生长曲线表明难以沿用细菌的生长曲线来描述胞内微生物在宿主细胞内的生长过程。
Quantitative assay of Rickettsia prowazekii growth in host cells by using 16S rRNA probes HU Fuquan, JIN Xiaolin, LIU Qifu, et al. Department of Microbiology, The Third Military Medical University, Chongqing 400038
【 Abstract 】 Objective Using the Rickettsia prowazekii as a model to establish a quantitative assay for determining the intracellular-microorganisms growth in the host cells.Methods The total RNA extracted from the host cells infected by Rickettsia prowazekii or the infected-cell lysate with quanidinium thiocyanate was hybridized to specific 16S rRNA probes labelled with 32 P, then the RNase protection assay was conducted. Based on the number of bound probes, the number of target sequence molecules could be figured out.Results 3.94×104 16S rRNA molecules of R. prowazekii were detected from 0.5μl of the infected-cell lysate, and 5.82×104 from 6pg of total RNA sample. Determined growth curve of R. prowazekii in host cells displayed only the lag and log phases without stationary and declining phases.Conclusions The results showed that the RNase protection assay can be used to determine the growth of intracellular microorganisms in host cells, and the intracellular microorganisms may have different growing patterns for the extracellular bacteria.
【 Subject words 】 Rickettsia prowazekii RNase protection assay RNA probes
立克次体等胞内生长微生物不能在固体培基上生长形成克隆，难以用类似活菌计数这样的方法来做定量测定。显微镜下直接计数因其个体微小而难以进行。若欲分离纯化胞内寄生物，再用分光光度法测定，则面临分离操作难度大、分离过程中难免的样品丢失和污染蛋白影响定量准确等问题。空斑测定可视为一种克隆计数法，但需6～8天才能得到结果〔1，2〕，且有些胞内寄生物生长后无明显细胞病变而不形成空斑，故胞内生长微生物的定量测定一直是一个问题。我们用普氏立克次体16S rRNA特异性探针作RNA酶保护分析建立了定量测定立克次体胞内繁殖量的方法。
材料与方法
1.细胞培养与感染：用L929细胞为立克次体宿主细胞。用含10％小牛血清的MEM培养基(Gibco公司产品) 在5％ CO2条件下培养细胞。立克次体感染宿主细胞采用悬液感染法〔3，4〕。用于测定胞内生长曲线的培养物，分别在感染后的0，6，12，24，36，48小时终止培养，用细胞直接裂解法制备样品。同时，培养不感染立克次体的正常细胞，按后述方法制备裂解物和提取总RNA，供试验中的阴性对照用。
2.细胞裂解物的制备：取培养细胞(感染与未感染)，去除培养上清，每个平皿(100mm)加入2ml细胞裂解液(含5mol/L硫氰酸胍，Sigma公司产品),用吸管吹吸使细胞裂解。裂解物直接用于测定。
3.细胞总RNA提取：取上述平行培养的细胞，去培养上清，每个平皿中加入0.5ml 0.3mol/L葡萄糖溶液及0.5ml 2％SDS溶液 (两者均溶于pH4.5的10mmol/L醋酸钠缓冲液中)，收集溶解细胞，置水浴中5分钟，加1ml预热至70℃的水饱和酚，再置70℃ 3分钟，12 000r/min离心10分钟。收集上清，重复上述抽提步骤，共三次。最后用0.3mol/L NaCl及2.5倍体积的冰无水乙醇沉淀核酸，再混悬于无RNA酶双蒸水中，-80℃保存备用。
4. 16S rRNA探针的制备：培养HW40细菌，用Wizard质粒提取试剂盒(Promega公司产品)，按操作说明提取质粒pHW40。该质粒中含有立克次体16S rRNA基因中的525个碱基序列〔4，5〕 。用EcoRⅤ使质粒线性化后作为模板，用试管内转录法生成探针： 取10×转录缓冲液2μl， 0.2mol/L DTT 1μl，rRNasin 20U，10mmol/L的ATP、GTP及CTP各1μl，0.1mmol/L UTP 2.4μl，32P-UTP 5μl(370kBq/μl)，线性化模板DNA 1μl(1μg)，T7 RNA聚合酶20U, 最后加水至20μl总体积。在25℃孵育60分钟后加入DNase 2U，孵育37℃ 15分钟以降解模板DNA。反应毕，用酚/氯仿法纯化探针。最后将探针混悬于200μl无RNA酶双蒸水中,并通过三氯醋酸沉淀法测定32P-UTP的掺入率(Ri)：
注：CPM即放射性强度
5. RNA酶保护分析〔6-9〕：将不同量的样品分别与5μl标记探针混合，加水至100μl，用冰乙醇沉淀，再将沉淀混悬于30μl杂交缓冲液(40mmol/L pipes，1mmol/L EDTA，0.4mol/L NaCl，10％甲酰胺) 中，42℃杂交反应过夜。再向反应管中加入30μl RNase酶解液(300mmol/L NaCl，pH7.4的10mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，RNase A 10μg/ml，RNase T1为2U/ml)，37℃孵育60分钟，在此期间，未形成杂交体的RNA分子(包括被检测序列和探针) 被RNase裂解。随后加30％TCA沉淀杂交分子。用过滤法收集沉淀物，用30％TCA及冰乙醇各洗膜3次，最后用液闪计数仪测定沉淀物中的CPM。
结 果
1.标记探针分子数的计算：探针与所检测的靶分子的结合是1∶1，通过被结合的探针分子数即可知测到的靶分子数。下面是探针溶液中探针分子数的计算。
(1) 标记探针时投入的32P-UTP分子数: 标记时用了5μl(15.4μmmol/L)的32P-UTP，故其中含77pmol，每pmol含有66.023×1011分子，故有：
6.03×1011×77＝4.64×1013(分子) (Ⅰ)
(2)标记探针时投入的UTP分子数：标记时用了2.4μl (0.1mmol/L) UTP，其中含有240pmol，故有：
6.023×1011×240＝14.45×1013(分子) (Ⅱ)
(3)标记UTP占总UTP的百分数：由(Ⅰ)、(Ⅱ)式可知：
4.64×1013/(4.64×1013＋14.45×1013)＝24.3％ (Ⅲ)
(4)总探针中结合进去的32P-UTP分子数为：
4.64×1013×Ri (Ri为掺入率，实测得到) (Ⅳ)
(5)每个探针分子中结合进去的32P-UTP分子数：根据模板碱基序列，可知在本系统中， 每个探针分子共有136个UTP，其中32P-UTP 应占24.3%，故：
136×24.3%=33(个) (Ⅴ)
(6)探针制备中生成的探针分子总数：用掺入探针的总32P-UTP数〔见(4)〕除以每个探针中的32P-UTP数〔见(5)〕即得此值：
(7)每μl探针中的探针分子数：由于总探针混悬在200μl中，故有：
在(Ⅶ)式中，只有Ri是未知数，每次探针标记后，根据实测的Ri，就可知道每μl探针溶液中含有多少探针分子数。取1μl探针溶液测定其放射性强度。根据下式：
我们就可计算出每个CPM值代表了多少探针分子数。
2.总RNA样品的实测结果：用总RNA为样品实测是为了观察该方法的敏感性。在实际应用中只需用裂解物作为样品即可。每次探针标记后，根据(Ⅶ)式即可标出每微升探针所含的探针分子数。用1μl探针测定到CPM值，再根据(Ⅷ)式，就可算出CPM值和探针分子数之间的关系。这样，在标本检测中，根据测定到的CPM值，就可以计算出检测到的靶分子数。表1是3次检测总RNA样品所得结果。根据文献〔4，10〕，知道每个立克次体含核糖体数(即rRNA分子拷贝数)为1 500。故靶分子数除以1 500得到立克次体数。
表1 总RNA样品的实测结果
Tabe 1. Results from total RNA
| Total RNA(μg) | |||||||
| 0.375 | 0.188 | 0.093 | 0.047 | 0.024 | 0.012 | 0.006 | |
| CPM | 3 212 | 1 656 | 1 084 | 488 | 104 | 88 | 56 |
| No.of 16S rRNA | 3.33×106 | 1.72×106 | 1.12×106 | 5.06×105 | 2.12×105 | 9.30×104 | 5.82×104 |
| No.of Rickettsia | 2 220 | 1 146 | 680 | 337 | 141 | 62 | 39 |
3.感染细胞裂解物的测定结果：表2为3次用感染细胞裂解物测定的结果。裂解物测定与总RNA测定为平行实验，每次所用的探针相同，故计算方式也相同。
表2 感染细胞裂解物的测定结果
Tabe 2. Results from lysate of infected cells
| Lysates of infected cells(μl) | |||||||
| 32 | 16 | 8 | 4 | 2 | 1 | 0.5 | |
| CPM | 2 896 | 1 382 | 740 | 386 | 188 | 84 | 38 |
| No.of 16S rRNA | 3.01×106 | 1.43×106 | 7.68×106 | 4.01×105 | 1.95×105 | 8.7×104 | 3.94×104 |
| No.of Rickettsia | 2 006 | 957 | 511 | 267 | 130 | 58 | 26 |
4.普氏立克次体在宿主细胞内的生长曲线：用立克次体感染宿主细胞后，在不同时相点取样，制备细胞裂解物，用RNA酶保护分析法试测了在宿主细胞内的生长曲线(图1)。结果显示，立克次体在接种后的最初几小时内显示了一个相对平缓的迟缓期，随后进入对数生长期(但曲线斜率较细菌小)。曲线未显示出细菌生长曲线中的稳定期和衰退期。
图1 普氏立克次体在L929细胞内的生长曲线
Fig 1. Growth curve of Rickettsia prowazekii in L929
讨 论
实践中胞内生长微生物的定量测定一直是个问题。我们以胞内生长菌普氏立克次体为模型，建立了用RNA酶保护分析法作为胞内生长微生物的定量测定方法。结果表明，用硫氰酸胍裂解感染细胞，用裂解物直接做RNA酶保护分析有几大优点：①硫氰酸胍在裂解细胞的同时，灭活了RNase,使得RNA样品不受降解，保证了样品的完整性，且样品中的硫氰酸胍并不影响随后的核酸杂交，这使得直接用裂解物做测定成为可能。②直接用裂解物做测定，省去了对胞内寄生物或其结构成分进行分离纯化的过程，避免了纯化过程中难免的样品丢失，提高了测定的准确性。③省去纯化过程使方法简化，缩短了试验时间，通常可在24小时内获得实验结果，较之空斑定量法有大大提前，可与细菌学中的活菌计数相比拟。④本法的高度特异性是建立在RNA酶保护分析法基础上的，只要被检核酸与探针序列互补或仅有一至数个碱基不配对，都可被RNA酶保护分析法区分开，故其特异性高于Southern或Northern杂交。方法将定量测定从微生物个体水平提高到分子数测定水平。
本方法的基本要求是要清楚被测对象的一段特异性核苷酸序列(作为探针)。实际上本方法实用于定量测定一切有已知特异序列的对象(如病毒等)，并不限于本文中测定的立克次体。
工作中实测了普氏立克次体的生长曲线。细菌的生长曲线包括迟缓期、对数生长期、稳定期及衰退期。本文中我们没有发现立克次体在胞内生长的稳定期和衰退期。这首先可被解释为观察时间不够长所致。但需注意，细菌在8～10小时即出现稳定期，而本文观察到48小时尚未见到此期(若再延长时间，则因绝大多数宿主细胞因感染而崩解，无法继续实验)。原因何在?胞内生长微生物没有稳定期和衰退期吗?我们分析可能是因为胞内生长微生物的宿主细胞在感染、死亡之前，本身具有自身调节和自身内稳定功能，这对于胞内寄生物来说是一个相对稳定的、理想的生长环境〔11，12〕，故只要有可供寄生的宿主细胞群存在，寄生物就能维持对数生长状态。一旦因为寄生物使培养中的所有细胞都感染，且增殖量达到某一极限，使所有感染细胞突然死亡崩解，细胞内寄生物的增殖也就突然止于此点。因此我们在实验中就看不到稳定期和衰退期。这种解释对于那些杀细胞性胞内寄生物可能是成立的。某些非杀细胞性寄生物可以与宿主细胞建立稳定的持续感染状态，观察不到衰退期也是极自然的事。这里的结果提示胞内寄生物繁殖有其自身特点，恐难以沿用细菌的生长曲线来描述胞内寄生物的生长过程。
曲线的另一特点是上升斜率较细菌生长曲线小，这可能反映出立克次体较细菌增殖速度慢得多的特点。这与普氏立克次体繁殖一代的时间在34℃时约为10小时的事实相符〔10〕。
参考文献
[1]Ormsbee RA,Peacock MG.Rickettsial plaques assay and cloning procedure.Tissue Culture Assoc,1976,2∶475-482.
[2]Xiaoxing C,Shurong Y and Guoquan Y,et al.Red plaque formation of Coxiella burnetii and reduction assay by monoclonal antibodies. Acta,1989,33∶281.
[3]Austin FE,Winkler HH.Proline incorporation into protein by Rickettsia prowazekii during growth in chinese hamster ovary (CHO-K)cells.Infect Immun,1988,56∶3167-3172.
[4]Pang H,Winkler HH.Copy number of the 16S rRNA gene in Rickettsia prowazekii J Bacteriol,1993,175∶3893-3896.
[5]Weisburg WG,Dobson ME,Samuel JE,et al.Phylogenetic diversity of the Rickettsiae. J Bacteriol,1989,171∶4202-4206.
[6]Haines DS,Gillespie DH.RNA abundance measured by a lysate RNase protection assay.Biotechiques,1992,12∶736-741.
[7]Thompson J,Gillespie D.Molecular hybridization with RNA probes in concentrated solution of guanidine thiocyanate.Anal Biochem,1987,163∶281-291.
[8]Zin K,Dimaio D,Maniatis T,et al.Identification of two distinct regulatory regions adjacent to the human β-interferon gene.Cell,1983,34∶865-879.
[9]Myers RM,Larin Z,Maniatis T, et al.Detection of single base substitutions by ribonuclease cleavage at mismatches in RNA:DNA duplexes.Science,1985,230∶1242-1246.
[10]Pang H,Winkler HH.The concentration of stable RNA and ribosomes on Rickettsia prowazekii Molecul Microbiol,1994,12∶115-120.
[11]Winkler HH.Transport of "～" by an obligate intracellular bacterium,Rickettsia prowazekii.In: Molecular Biology and Infectious Diseases,ed by Schwartz M,1988,P.201-206.
[12]Winkler HH.Rickettsia specise(as organisms).Annu Rev Microbiol,1990,44∶131-153.
(收稿：1997-10-24 修回：1998-03-25)