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口服髓鞘碱性蛋白诱导免疫耐受治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究

来源:中华微生物学和免疫学杂志
摘要:口服髓鞘碱性蛋白诱导免疫耐受治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究中华微生物学和免疫学杂志1999年第2期第19卷免疫治疗作者:刘学彬谢蜀生单位:100083北京医科大学免疫学系关键词:髓鞘碱性蛋白。免疫耐受【摘要】目的建立实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)动物模型,探讨口服自身抗原诱导免疫......

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口服髓鞘碱性蛋白诱导免疫耐受治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第2期第19卷 免疫治疗

作者:刘学彬 谢蜀生

单位:100083 北京医科大学免疫学系

关键词:髓鞘碱性蛋白;自身免疫性脑脊髓炎;自身免疫疾病;免疫耐受

  【 摘要 】 目的 建立实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)动物模型,探讨口服自身抗原诱导免疫耐受对大鼠EAE的防治作用。方法 在普通Wistar大鼠经1次足跖真皮内注射完全弗氏佐剂-豚鼠全脊髓匀浆或完全弗氏佐剂-髓鞘碱性蛋白乳剂加百日咳疫苗诱发EAE疾病;另在大鼠致炎前及发病后口服髓鞘碱性蛋白(MBP),观察其对EAE的防治作用。结果 在Wistar大鼠成功地诱发了EAE,发病率将近90%。大鼠在致炎前口服MBP,可明显推迟EAE发病时间,降低EAE发病率,使神经组织病理改变明显改善。大鼠发生EAE后给予MBP,可明显控制发病动物的病情,使病程缩短及减轻患鼠神经组织的炎症程度。另外,在耐受鼠由MBP引起的迟发型超敏反应(DTH)以及体外针对MBP的淋巴细胞增殖反应也明显受到抑制。结论 口服MBP可引起特异性的免疫耐受,从而产生对实验性自身免疫性脑脊髓炎的防治作用。

  Suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis by oral administration of myelin basic protein LIU Xuebin, XIE Shusheng. Department of Immunology, Beijing Medical University,Beijing 100083

  【 Abstract 】  Objective To establish on animal model of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), and to investigate the therapeutic effect of orally administrated myelin basic protein (MBP) on EAE.Methods With guinea pig spinal cord homogenate in complete Freund's adjuvant (CFA-GPSCH) or MBP in complete Freund's adjuvant (CFA-MBP) and Bordetella pertussis vaccine (BPV) was injected intradermally to induce EAE in Wistar rats. To investigate the suppression of clinical and histological manifestations of the disease when animals were fed with MBP before or after disease induction.Results With CFA-GPSCH or CFA-MBP and BPV, we succeeded in the induction of EAE in Wistar rats, and the incidence of EAE was more than 90%. The clinical expression of the disease was suppressed whether animals were fed with MBP before or after sensitization, the incidence of EAE was dramatically decreased in animals which were fed with MBP before disease induction, and the duration of disease was shortened significantly in animals which were fed with MBP after onset of the disease. Histological examination revealed a marked reduction of perivascular infiltrates in rats fed with MBP either before or after sensitization to MBP. In addition, DTH responses to whole MBP were suppressed and the suppression of in vitro proliferative responses to MBP were observed to be antigen specific.Conclusions EAE can be prevented and cured by oral administration of MBP to induce specific immunologic tolerance.

  【 Subject words 】 Myelin basic protein  Autoimmune encephalomyelitis  Autoimmune disease  Immune toleranc

  实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis , EAE)是发生在动物中枢神经系统内,由CD4+T淋巴细胞所介导的自身免疫性疾病,是目前被公认为人类多发性硬化症(multiple sclerosis , MS)的理想动物模型〔1〕。髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)为存在于中枢神经系统髓质内的一种主要蛋白成分,是引起EAE的主要靶自身抗原〔2〕。在敏感动物通过真皮内注射CEA-MBP,可诱发EAE疾病,患鼠表现为进行性肢体麻痹及病理上局限于大脑和脊髓灰白质区外周血管大量单核、淋巴细胞浸润等,EAE与MS在临床、生化、免疫及病理等方面具有相同的特征。国外对EAE研究非常活跃,而国内目前对其研究甚少。建立EAE模型,有助于人们更好地阐明MS等中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病的发病机制,为尚无特效疗法的MS疾病的防治提供理论依据。由于目前国内缺乏EAE敏感鼠,故我们采用豚鼠全脊髓匀浆(GPSCH)及MBP在普通Wistar大鼠中诱导EAE,并以自提的MBP作为耐受原,通过口服诱导耐受,用于大鼠EAE的预防和治疗。结果建立了稳定的EAE动物模型并成功地诱导了MBP的口服免疫耐受,获得了显著疗效, 现报告如下。

  材料与方法

  1.动物:豚鼠,体重300~400g。Wistar大鼠,6~8周龄,雌性,体重(180±30)g,供诱导EAE和口服耐受用,均由北京医科大学实验动物部提供。

  2. 试剂:MBP(本室从豚鼠脑、脊髓中提取的产品,以豚鼠脑、脊髓为原料,通过反复去脂、抽洗、酸溶解、高速离心等步骤提取MBP,再过柱纯化,-20℃保存备用),完全福氏佐剂(CFA,美国DIFCO产品),百日咳疫苗(BPV,10×1010个菌/ml,北京生物制品研究所产品)。

  3. CFA-GPSCH及CFA-MBP乳剂的制备〔3〕:豚鼠心脏抽血处死,取脊髓制成50%(重量/体积)的生理盐水匀浆,与等量的每毫升4mg卡介苗的CFA混合,置2只注射器中来回抽推制成GPSCH/CFA油包水乳剂,4℃保存备用。配制MBP/CFA时,取本室提取的豚鼠MBP与CFA混合,按上述方法制成每升含MBP 1克的乳剂备用。

  4. 大鼠EAE的诱导〔4〕:Wistar大鼠一侧后足跖真皮内注射GPSCH/CFA或MBP/CFA乳剂0.1ml,同时大鼠后脚背皮内注射0.2ml百日咳疫苗。每天观察EAE发病情况,并按下列标准进行神经症状分级评分:0级,无明显异常;1级,尾巴麻痹;2级,后肢无力;3级,后肢麻痹;4级,后肢麻痹伴有前肢无力或麻痹或因EAE而死亡。

  5. 口服诱导免疫耐受〔6〕:实验分2批,一批为预防EAE发生,另一批为治疗EAE。先将MBP溶于PBS中,配成1g/L备用。预防组分别于10、8、6、4、2天给大鼠灌胃MBP 1次,每次每鼠1.5mg,共5次,对照组口服PBS或牛血清白蛋白(BSA),于0天用GPSCH加CFA免疫大鼠诱导EAE,观察上述动物发病及疾病进展情况。治疗组在致炎后动物发生EAE当天开始,每天灌胃MBP 1.5mg,连续7天,观察动物疾病进展情况。

  6. 体外对MBP特异刺激的淋巴细胞增殖实验〔6,7〕:大鼠分别口服MBP或BSA,再以MBP-CFA致敏后第12天,处死动物,无菌取致敏足跖一侧的腹股沟淋巴结,研碎过100目钢网,Hanks液洗2遍,制成淋巴结细胞悬液,RPMI 1640培养液调细胞浓度为2×106/ml。将上述细胞加入96孔培养板中,200μl/孔,再每孔加入20μg的MBP或0.2μg的ConA,置37℃,5% CO2孵箱中培养66小时,每孔加入20μl MTT(5g/L),再培养6小时后,将培养板离心(2000r/min ,10分钟),弃上清,再每孔加入100μl 酸化异丙醇(含0.4mol/L HCl)室温静置15分钟后,轻摇数次使沉淀物(蓝色甲 结晶)充分溶解,30分钟内于570nm处测各孔吸光度A值,以(A)值反映淋巴细胞增殖程度。

  7. 迟发型超敏反应(DTH)试验〔8〕:所有动物用MBP-CFA致敏后第15天,大鼠耳朵皮内注射25μg/0.1ml的MBP,用压力敏感测微仪测各鼠耳朵厚度,比较各鼠注射抗原前和注射抗原48小时后耳朵厚度之差异。

  8. 神经组织病理检查:大鼠发病将近死亡、刚死亡或免疫后第16天处死,迅速取脑和脊髓固定于10%福尔马林液中,石蜡包埋,切片(7~10μm厚),HE染色,光镜下观察并拍照记录结果。

  9. 统计学处理:数据以

  结 果

  1. Wistar 大鼠发生EAE的临床表现:大鼠经GPSCH-CFA、MBP-CFA或单纯GPSCH、MBP免疫后第9~14天,相继出现明显的EAE症状,大鼠表现为精神萎靡,体重下降,先出现尾巴麻痹,继而出现双后肢麻痹、瘫痪,严重者发展到四肢瘫,尿便失禁甚至死亡。GPSCH-CFA免疫的动物发病率较高,症状明显。增加百日咳疫苗用量,发病率可提高,症状加重,部分动物死亡,结果见表1。

  表1  MBP致敏Wistar大鼠诱发EAE的作用

  Table 1.Development of EAE in Wistar rats immunized with MBP

EAE induction antigen Day of onseta Incidence of EAEb Clinical scorec Mortality
Control(CFA)   0/6 0 0/6
MBP/CFA 10-14 5/8 2.0±0.5 0/8
MBP/CFA +BPV 9-14 7/8 3.5±0.3 0/8
GPSCH/CFA 12-16 4/8 2.5±0.5 0/8
GPSCH/CFA+BPV 10-14 13/15 3.8±0.4 2/15

  a. Range of day of onset of disease for animal within each group;b. Numbers of rats with EAE/numbers of rats in each group;c. Mean of the scores assessed on day 16 in each group2. 口服MBP诱导耐受防治EAE作用:Wistar大鼠在发病前经数次口服MBP后,其EAE发病情况如表2所示。MBP预防组发病率仅27%,发病时间明显推迟,症状轻,而EAE阳性对照组发病率则达90%,发病时间早,症状重,病程长并有死亡。MBP治疗组表现为,大鼠发生EAE当天即开始口服MBP 可明显抑制疾病发展,使病程缩短,在第16天,口服MBP组疾病评分较EAE对照组评分明显低。结果表明,口服MBP可以有效地诱导出对EAE的免疫耐受,从而发挥防治EAE的作用。

表2 口服MBP对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用

  Table 2. Effect of feeding MBP to rats on the development of EAE

Group Feeding Mean days of onset Incidence of EAE Clinical score(day16) Mean duration(days)a
EAE control PBS 12.0±1.6 13/15(90%)  3.8±0.4 8.2±1.3
MBP prevention MBP 14.6±0.6*  3/11(27%)**  1.7±0.6**  5.6±0.4**
MBP treatment MBP 11.8±0.4    0.2±0.3**  3.5±0.5**

  *P<0.05,**P<0.01 vs control;a:Mean duration is the sum of the lasting days of the disease achieved by each rat divided by the number of rats is that group3. 口服MBP对淋巴细胞增殖反应的影响:大鼠口服MBP,再用MBP-CFA免疫后第12天,取致敏部位淋巴结,检测淋巴细胞增殖反应。结果显示,对照组(口服PBS组)与BSA口服组相近,对MBP特异刺激的淋巴细胞增殖反应均明显增强,而MBP口服耐受组针对MBP的淋巴细胞增殖反应则明显被抑制(见图1),表明耐受所导致的对淋巴细胞增殖反应的抑制作用是抗原特异性的。

图1 口服MBP对淋巴细胞增殖反应的影响

  Fig 1. Effect of feeding MBP on proliferative responses to MBP

  4. 迟发型超敏反应(DTH):检测DTH反应可了解机体对MBP的细胞免疫情况,各组大鼠致敏后第15天,于耳廓皮内注射MBP,观察注射前及注射48小时后耳朵肿胀程度,以注射前后耳朵厚度之差反映肿胀程度,结果见图2。在EAE对照组和口服BSA组可见明显的DTH反应,而口服MBP的耐受动物,其DTH反应则明显受到抑制。

  图 2 口服MBP对EAE大鼠迟发型超敏反应(DTH)的影响

  Fig 2. Effect of orally administered MBP on the EAE rats DTH responses

  5. 病理检查结果:经HE染色,EAE发病组可见大脑、脑干白质区血管周围,尤其是小静脉周围有大量单核细胞和淋巴细胞浸润,形成典型的血管“套袖” 状改变;部分可见神经组织液化、灶性坏死,胶质细胞增生;但未检测到髓鞘裂解情况(见图3)。正常对照组则未见上述任何病理变化。口服MBP组动物,无论是致炎前还是致炎后口服MBP,均能明显减轻上述病理改变,耐受组的部分动物甚至检测不到任何病理损害,提示口服MBP引起的免疫耐受减轻了脑组织病变。

  图3 口服MBP对诱发EAE大鼠神经组织病理改变的影响

  Fig 3. Effect of feeding MBP on histopathology of EAE rats actively induced by MBP(HE 10×)

  讨 论

  EAE是由CD4T淋巴细胞介导的局限于中枢神经系统的自身免疫病,目前EAE已被广泛用作研究人类MS的理想动物模型,国内对其研究甚少。以前人们通过多种方法来抑制EAE、MS的发生及进展,但主要都是非特异的治疗,如免疫抑制药的大量使用。由于这类治疗毒副作用大,且无特异性,不能有效地从根本上控制疾病的发生、发展,因而限制了其临床使用。近年来,人们在过去传统方法的基础上研究用抗原特异性的疗法,纠正EAE和MS异常免疫环节,从而达到预防和治疗EAE和MS的目的,其中研究的比较活跃的是利用免疫耐受的原理进行防治自身免疫病,诱导机体对自身抗原特异的免疫耐受是治疗自身免疫病的理想疗法。

  口服耐受很早就被认识到是一种有效的诱导外周免疫耐受的重要方法,近几年来,它在EAE、MS等自身免疫病治疗方面的研究取得了重大进展〔9〕。经研究证实,神经组织中的MBP是诱发EAE和MS疾病的主要靶抗原,EAE可以通过给动物注射MBP或GPSCH与CFA诱发,但在实验动物中并非所有品系动物都可建立EAE模型,常用的比较敏感的鼠类动物有SJL/J小鼠、Lewis、DA大鼠以及豚鼠〔10〕。由于国内缺乏敏感鼠,我们在普通Wistar大鼠中成功地建立了EAE动物模型,发病率可达90%,同时进一步证实百日咳疫苗可提高发病率。实验结果还证明,口服MBP组动物,其体外由MBP刺激的淋巴细胞增殖反应明显受到抑制,而且是抗原特异性的。此外,耐受组动物对MBP引起的DTH反应也明显被抑制。

  口服MBP对诱发EAE产生的防治作用,是口服MBP特异地诱导免疫耐受的结果。口服耐受用于预防和治疗EAE,显示出方便、无毒及特异性好的特点,为进一步研究MBP抗原性与自身免疫病的关系及其发病机制创造了条件,我们将对口服耐受防治EAE做进一步研究,探讨口服耐受的机制,为临床上治疗MS疾病提供试验依据。

  本课题为国家教委博士点基金资助项目

  参考文献

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  [9]Weiner HL,Khoury S,Hafler DA,et al. Oral tolerance:immunologic mechanisms and treatment of animal and human organ-specific autoimmune disease by oral administration of autoantigens.Annu Rev Immunol,1994,12∶809-837.

  [10]林嘉友.实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠模型.中国免疫学杂志,1994,10(1)∶39-40.

(收稿:1997-11-05  修回:1998-07-20)


作者: 风清扬 2009-2-21
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