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钩端螺旋体疏水外膜蛋白(OmpL39)对豚鼠免疫功能影响的研究

来源:中华微生物学和免疫学杂志
摘要:钩端螺旋体疏水外膜蛋白(OmpL39)对豚鼠免疫功能影响的研究中华微生物学和免疫学杂志1999年第2期第19卷钩端螺旋体作者:张燕华刘家福曹勇吴俊梅阎蓉华单位:张燕华阎蓉华(610041成都,华西医科大学基础医学院钩端螺旋体病研究室)。细菌外膜蛋白质类。免疫活性。红细胞/免疫学【摘要】目的研究钩体......

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钩端螺旋体疏水外膜蛋白(OmpL39)对豚鼠免疫功能影响的研究

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第2期第19卷 钩端螺旋体

作者:张燕华 刘家福 曹勇 吴俊梅 阎蓉华

单位:张燕华 阎蓉华(610041 成都,华西医科大学基础医学院钩端螺旋体病研究室);刘家福(卫生部成都生物制品研究所菌苗室、实验动物中心);曹勇 吴俊梅(成都中医药大学微生物教研室)

关键词:钩端螺旋体属;细菌外膜蛋白质类;免疫活性;红细胞/免疫学

  【 摘要 】  目的 研究钩体蛋白抗原的免疫保护力及其机制。检定纯化的强毒017钩体相对分子质量为39×103的疏水外膜蛋白(OmpL39)对豚鼠的免疫保护力。对免疫应答期豚鼠红细胞免疫功能的变化进行观察,以期对钩体基因疫苗的研制提供依据。方法 用TX-114抽提钩体的不同蛋白成分,分三批对36只豚鼠进行免疫保护力试验,检测红细胞免疫功能RBC-C3b RR、RBC-ICR、RFER、RFIR的变化;用χ2检验、t检验处理数据,进行分析。结果 OmpL39 在豚鼠体内能产生高效价的显凝抗体 (MAT:1∶3200)。RBC-C3b RR、RBC-ICR均明显升高(P<0.05); 红细胞免疫粘附因子促进率(RFER)上升,抑制率(RFIR)下降,两者比值显著增大(P<0.05)。结论 OmpL39对豚鼠有有效的免疫保护力,在免疫应答期除增强体液免疫外,在提高红细胞免疫功能方面也起到了积极的作用。

  Effect of the 39 kD hydrophobic outer membrane protein of Leptospira interrogans on the immunity function of the guinea pigs ZHANG Yanhua*, LIU Jiafu, CAO Yong, et al. * Research Unit of Leptospira, Department of Pathophysiology of West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041

  【 Abstract 】 Objective To study the immunoprotective property of the 39kD hydrophobic outer membrane protein of Leptospira interrogans (OmpL39) to guinea pigs. For this end, the immunogenic function of GP red cells during immuno-responses has to be assayed. This is aiming at providing evidences for preparing genetic engineering vaccine against leptospirosis.Methods In a randomized control trial, 36 guinea pigs were divided into 4 groups and inoculated separately with OmpL39, whole leptospiral cell vaccine (WLCV) , other proteins of Leptospira and normal saline (negative control). Their immunoprotective properties and the red cell immunity function were tested. The results were analyzed by used of the χ2 and t test.Results The results showed that all the guinea pigs inoculated with OmpL39 and WLCV still survived after challenge, but all the control guinea pigs died. The immunoprotective effectiveness was 100% for OmpL39 and MLCV groups. OmpL39 levels were similar to that of WLCV and higher than control group (P<0.05). The OmpL39 could produce 100% immunoprotective effectiveness and has higher MAT levels. The red cell immunity property of the guinea pigs changed during immuno-response and the RBC-C3b RR and the RBC-ICR increased. The RFER increased, the RFIR decreased. RFER/RFIR was remarkably higher than that of control (P<0.05).Conclusions The OmpL39 could increase the red cell immunity function and could be used as important immunoprotective antigen to develop the genetic engineering vaccine.

  【 Subject words 】 Leptospira  Hydrophobic outer membrane  Immunoprotective  Erythrocytes/immunology

  在钩端螺旋体(钩体)病免疫作用机理的研究中,多数学者认为,体液免疫是消灭致病钩体的主要作用机制〔1〕 。至今未见钩体抗原对红细胞免疫影响及其机制的报道。本研究参照《中国生物制品规程》钩体疫苗制造和检定规程〔2〕,在卫生部成都生物制品研究所菌苗室和动物实验中心,用强毒017株钩体相对分子质量为39×103疏水外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)抗原OmpL39〔3〕 对豚鼠进行免疫力检定,并对豚鼠免疫应答期体液免疫和红细胞免疫功能的变化进行了观察,以期为钩体基因工程疫苗的研制及其免疫机制提供可靠的实验和理论依据。现将结果报道如下

  材料和方法

  1.钩端螺旋体:017株钩体由卫生部成都生物制品研究所菌苗室提供。

  2.钩体OmpL39 的抽提,分离和纯化:参照Haake的方法〔4〕,用TritonX-114(TX-114)抽提、分离017株钩体OMP,分别为疏水OMP(Omp疏)、亲水OMP(Omp亲)和原生质物。按常规SDS-PAGE分离纯化OmpL39 。

  3.OmpL39 免疫力检定试验

  (1)试验动物:健康荷兰种一级豚鼠(guinea pig,GP)36只,体重120~200g,在实验条件下先驯养一周(由卫生部成都生物制品研究所实验动物中心提供并饲养)。

  (2)抗原:Omp疏(hydrophobic OMP, Hpho-OMP); Omp亲(hydrophilic OMP,Hphi-OMP); OmpL39 (纯化017株钩体Omp疏39×103蛋白);OmpL39-(不含OmpL39的OMP)。

  (3)免疫力试验:①试验动物分批和分组。第一批试验选用15只健康豚鼠, 按随机化原则分为5组,分别为Omp疏(Hpho OMP)、Omp亲(Hphi-OMP)、原生质(protoplasmi cylinders,PC)、死菌苗(阳性对照)(whole leptospiral cell vaccine,WLCV)、生理盐水(阴性对照)组(Normal saline,NS)。第二批试验选用9只健康豚鼠按随机化原则分为3组,分别为OmpL39 、死菌苗(WLCV)、生理盐水组(NS)。第三批试验:选用12只健康豚鼠随机分为OmpL39 、OmpL39- 、死菌苗(WLCV)、生理盐水组(NS)。②免疫方法。腹股沟内侧及腹壁皮下多点注射,以氢氧化铝为佐剂,聚丙烯酰胺凝胶为辅助佐剂。③免疫时间和剂量。于实验第1天开始第1次免疫,第7天进行第2次免疫。于第2次免疫后10天抽心血做MAT。④攻击。于第2次免疫后15天, 用强毒017株钩体2ml(109条/ml)活菌腹腔攻击免疫豚鼠。⑤免疫力判定标准。按卫生部颁发的《中国生物制品规程》中检定钩端螺旋体疫苗规程〔2〕 ,测定抗体效价,统计豚鼠生存率,内脏出血程度、体重增减情况等指标,判定免疫力合格与否。

  合格标准:攻击后10天内,免疫组3只豚鼠应健存(living numbers of the assaulted,LNOA)(100%健存),对照组豚鼠至少应有2只患钩体病死亡(death numbers of the assaulted,DNOA),解剖动物,应有肺脏出血(pulmonary hemorrhage,PH)及皮下出血(subcutaneous hemorrhage,SH)等钩体病典型病变,免疫力(immunity efficacy IE)判为合格(pass,P),否则判为不合格(fail,F)。

  4.豚鼠红细胞免疫功能检测:参照刘景田方法〔5〕 进行。于实验开始第22天抽取心血2ml,析出血清用于检测。

  5.统计学方法:用χ2检验、t检验等处理试验数据,进行分析。

  结 果

  1.赖型钩体OmpL39 的SDS-PAGE分离和纯化:经TX-114抽提分离017钩体为疏水蛋白层、亲水蛋白层和原生质层;然后用制备电泳分离017株钩体疏水外膜蛋白,切下39×103区带,经洗脱回收并行SDS-PAGE, 可见39×103清晰蛋白条带 (见图1)。

图1 OmpL39 的SDS-PAGE图谱

  Fig 1. SDS-PAGE analysis of OmpL39

  1.Molecular size standards,2.OmpL39

  2.OmpL39 免疫力检定试验结果:将3批抗原免疫各组豚鼠,用017钩体攻击后,第一批15只豚鼠中Omp疏组3只豚鼠均健存,MAT强阳性(1∶3200)(以同组动物中最低滴度进行统计),无黄疸,无出血,与死菌苗组免疫力相当,免疫力判为合格;第二批9只豚鼠,OmpL39和死菌苗组免疫力仍判合格;第三批12只豚鼠中,OmpL39和死菌苗组仍判合格,其余各组均判不合格。将第一、二、三批免疫的豚鼠共36只的免疫结果进行整理分析,3批试验中,OmpL39 组9只豚鼠均健存,无黄疸,解剖无肺脏和皮下出血,判免疫力合格;Omp疏、阳性对照死菌苗组免疫力也判合格,其余各组均判免疫不合格(表1)。

表1 017株钩体攻击后豚鼠免疫力结果

  Table 1. The results of the guinea pigs immunity after assaulted by strain 017

Group OmpL39 Hpho-Omp OmpL39- Hphi-Omp PC WCLV NS T
GP 6 3 3 3 3 9 9 36
MAT 1∶3 200 1∶3 200 1∶800 1∶800 - 1∶1 600 - -
DNOA 0 0 2 2 3 0 9 16
LNOA 6 3 1 1 0 9 0 20
PH - - ++ +++ ++++ - ++++
SH - - ++ +++ ++++ + ++++
IE P P F F F P F

  P:pass, F:fail3.OmpL39 免疫力检定试验的统计学分析:将3批免疫力试验结果进行整理,其中将Omp疏组归入OmpL39,Omp亲和原生质组归为OmpL39- 组进行统计学处理。结果OmpL39 组与死菌苗组免疫力相当,差异无显著性(P>0.05),OmpL39 组免疫保护力明显优于OmpL39-组和生理盐水组(P<0.05)(见表2)。

表2 OmpL39免疫力试验统计分析结果

  Table 2. The statistics analysis of immunogenicity of OmpL39

Group GP LNOA DNOA
OmpL39  9  9  0
OmpL39-  9  2  7
WLCV  9  9  0
NS  9  0  9
Total 36 20 16

  *OmpL39 group compared with OmpL39- group or NS group: P<0.05

  **OmpL39 group compared with WLCV group :P>0.054.OmpL39 对豚鼠红细胞免疫功能的影响:经测定,用OmpL39 免疫豚鼠,其红细胞免疫粘附活性有较大变化。OmpL39 免疫组与空白对照组RBC-C3b RR、RBC-ICR差异有显著性(P<0.05), OmpL39 组红细胞免疫功能也明显优于死菌苗组(P<0.05),见表3。

         表3 OmpL39 对豚鼠红细胞免疫功能的影响(x±s)

  Table 3. Effect of OmpL39 on the red cell immunity function of the guinea pigs

Group GP RBC-C3bRR(%) RBC-ICR(%)
OmpL39 8 17.82±2.13 17.79±2.47
WLCV 8 13.56±1.10 13.56±1.25
NS 8  7.81±1.28  8.75±1.36

  5.OmpL39 对豚鼠红细胞免疫调节因子活性的影响:经测定,OmpL39 对红细胞免疫调节因子活性有明显影响,OmpL39 组和死菌苗组RFER均显著高于空白组(P<0.05), RFIR明显下降,RFER/RFIR显著高于空白组(P<0.005)。OmpL39 与死菌苗组也有明显差异,OmpL39 组明显优于死菌苗组(P<0.05),见表4。      表4 OmpL39 对豚鼠红细胞免疫调节因子活性的影响

  Table4. Effect of OmpL39 on the activity of the immunoregulation of the guinea pigs red cell(x±s)

Group GP RFER(%) RFIR RFER/RFIR
OmpL39 8 87.22±1.51* 13.01±1.51* 4.59±0.85*
WLCV 8 81.51±1.35* 22.40±1.03* 3.70±2.20*
NS 8  70.84±2.16**  29.70±0.98**  2.30±0.07**
P value   *∶**<0.05 *∶**<0.05 *∶*<0.05
    *∶*>0.05 *∶*>0.05 *∶**<0.05

   讨 论

  大量的研究表明,不同种属钩体OMP的组成,抗原分子结构的差异是钩体不同致病力的物质基础,所以钩体OMP的结构和免疫特征一直是国内外学者研究的热点,但至今尚无实质性进展。

  近年来,Haake等〔4〕 对钩体OMP的纯化和分离进行研究,他们用TX-114抽提分离流感伤寒型钩体,对减毒钩体菌株进行了分析,但至今未见对有毒株及毒力蛋白的表达及免疫保护力进行研究的报道。

  我们采用TX-114抽提、分离强毒017株钩体OMP,并用特异性抗体进行免疫印迹分析, 发现仅39×103疏水外膜蛋白能同时被抗017全钩体血清、抗017外膜血清和抗017外膜Mb E4 B7 G5 所识别,保持了稳定的免疫原性〔6,7〕

  对OmpL39 的免疫保护力进行正规鉴定,其免疫保护力可达到中国生物制品规程要求判定合格。而不含OmpL39 的钩体各组分免疫力不合格。本结果表明,OmpL39 是钩体十分重要的免疫保护性抗原。经统计学处理:OmpL39 实验组与阴性对照组的免疫保护力差异有显著性(P<0.05),OmpL39 组与死菌苗组的免疫保护力差异无显著性(P>0.05),OmpL39 显示出极强的完全性免疫保护作用。值得注意的是,OmpL39-和Hphi-Omp两组的滴度均达到有保护作用的范围(1∶800),却未达到正规钩体疫苗免疫保护力的要求。提示,OmpL39-和Hphi-Omp的蛋白中仍有保护性抗原存在,但不具备完全性免疫保护作用,不能承受足量强毒钩体的攻击。其具体的结构特征,有待进一步探讨。

  试验中,我们还对OmpL39对豚鼠免疫应答期红细胞免疫功能进行了研究。结果发现,OmpL39抗原对RBC-C3b RR和RBC-ICR有明显影响, 其中RBC-C3b RR,RBC-ICR均明显升高, 红细胞免疫粘附因子促进率(RFER)与抑制率(RFIR)的比值增大(P<0.01)。提示,OmpL39 在免疫应答期除了增强体液免疫外, 还能刺激机体提高红细胞免疫功能,在保护豚鼠提高免疫力中起了重要的作用。红细胞免疫是80年代初提出的。有研究证实, 红细胞参与机体的免疫调控,并存在完整的自我调控系统〔8〕。红细胞的功能,主要用红细胞C3b受体粘附酵母菌花环率(RBC-C3bRR)及红细胞免疫复合物花环率(RBC-CIR)表示,反映其免疫粘附活性的强弱和功能状况。检测血清中红细胞免疫粘附促进因子及抑制因子活性, 可了解红细胞免疫功能自身调控因素的情况。从而判定机体红细胞免疫状况和清除CIC的能力。本文研究表明,用OmpL39抗原免疫豚鼠,能明显提高豚鼠红细胞免疫粘附活性,明显增强豚鼠血清红细胞免疫促进因子的活性,减少豚鼠血清红细胞免疫抑制因子的活性,同时能增大RFER与RFIR间的比值,促进红细胞的免疫功能,带动整个免疫系统的功能,这种作用优于现有死菌苗。这一结果提示,OmpL39作为钩体重要的免疫保护性抗原,除能产生特异性体液免疫作用外,还能刺激机体红细胞免疫功能发挥积极作用,在构建钩体基因工程疫苗中有十分重要的研究价值。

  志谢:承蒙成都中医药大学微生物与免疫学教研室骆永珍教授和日本福山大学微生物教研室福长将仁教授大力支持和帮助,特此致谢。

  本课题受国家自然科学基金资助(39670304)

  参考文献

  [1]魏曦,钩端螺旋体病学,北京:人民卫生出版社, 1982,第1版∶338-342.

  [2]中华人民共和国卫生部.中国生物制品规程.第一部,北京:卫生部生物制品标准化委员会编辑出版,1990,61-63.

  [3]张燕华,舒有君,戴保民. 赖型钩端螺旋体疏水外膜蛋白及免疫特性的研究. 华西医科大学学报,1997,28(2)∶128-131.

  [4]Haake DA, Walker ED, Blanco DR,et al.Changes in the surface of leptospira interrogans servar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infection and Immunity, 1991, 59(3)∶1131-1140.

  [5]刘景田. 红细胞免疫一步法测定. 郭峰、骆永珍主编.红细胞免疫学新探.南京:南京大学出版社. 1993,120-123.

  [6]张燕华,许玉堂,曹勇,等.不同种属钩端螺旋体疏水外膜蛋白的研究.中华微生物学和免疫学杂志,1998,18(3)∶190-193.

  [7]张燕华,方鲁延,许玉堂,等.OmpL39在致病钩端螺旋体中的表达和免疫特征的研究.华西医学,1997,12(1)∶44-47.

  [8]Siegel I,Lin TL,Gleicher N,et al.The red-cell immune system. Lancet, 1981,2∶556-559.

(收稿:1997-11-18  修回:1998-02-20)


作者: 风清扬 2009-2-21
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