抗人纤维蛋白单链抗体重链可变区的人源化

抗人纤维蛋白单链抗体重链可变区的人源化

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第3期第19卷 基因工程抗体

作者：李文平　蔡英林　许静　李彬　许复华　宋增璇

单位：300020　天津　中国协和医科大学　中国医学科学院血液学研究所实验血液学国家重点实验室

关键词：单链抗体；免疫原性；人源化

　　【 摘要 】　目的　人源化抗人纤维蛋白单链抗体的重链，降低人抗鼠抗体反应。方法　从基因文库中挑选到与鼠源抗人纤维蛋白单链抗体重链（V_H-8E5）同源性71.8％的人源免疫球蛋白HUMHCH109重链(V_H )序列，作为人源化改造V_H-8E5的框架。人工合成人源化V_H-8E5片段，用连接酶连接成完整的人源化V_H-8E5，构建表达载体pOPE101-V_H-8E5。转化JM109后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。结果　经聚丙烯酰胺电泳和ELISA证明表达产物相对分子质量30×10³左右，有特异性识别和结合人纤维蛋白能力，是亲本抗体ScFv-8E5活性的4/5左右。人源化ScFv-8E5表达产量为转化菌总蛋白的11.2% 。结论　人源化V_H-8E5仍具有特异性识别人纤维蛋白的活性，ScFv-8E5重链的人源化基本获得成功。

Humanized heavy variable region of anti-human fibrin ScFv-8E5

LI Wenping, CAI Yinglin, XU Jing, et al. Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020

　　【 Abstract 】　Objective　To humanize the V_H of anti-human fibrin ScFv-8E5 for minimizing the human anti-mouse antibody response.Methods We have constructed a “humanized ” antibody by combining the complementarity-determining regions (CDRs) of V_H in the anti-human fibrin ScFv-8E5 with human framework. The human framework regions were chosen to maximize homology (71.8%) with the anti- human fibrin ScFv-8E5 sequence. A few mouse amino acids were also retained in the humanized antibody. Humanized V_H -8E5 fragments were synthesized and combined into an intact heavy variable region. An expression vector pOPE101- V_H -8E5 was constructed by substituting the V_H -8E5 with humanized V_H -8E5.The transformed E.coli JM109 cells were propagated and induced by IPTG.Results Expression product was found in the total cell extracts and periplastic fractions by SDS-PAGE and ELISA. It was a 30kD single-chain fragment with human fibrin-binding specificity. The humanized ScFv-8E5 has an affinity for human fibrin about 4/5 that of murine ScFv-8E5. The yield of the humanized ScFv was 11.2% of the total bacterial proteins.Conclusion The humanized ScFv-8E5 showed antigen-binding capacity of the parental ScFv. It should be successful to humanize the V_H of ScFv-8E5.

　　【 Subject words 】　Single-chain antibody　　Immunogenicity　　Humanization

　　血栓形成的发病率及死亡率均较高，危害人类健康的许多严重疾病如冠心病、心肌梗塞、脑梗塞、肺梗塞、周围动脉闭塞性疾病等均与血栓形成密切相关。血栓尾部主要由纤维蛋白构成，因此抗人纤维蛋白单链抗体与放射性核素、效应分子结合^〔1〕可用于血栓性疾病的定位诊断和导向溶栓治疗，有很好的应用前景。但是异源蛋白会引起人抗小鼠抗体反应，而人源性单抗的生产又有许多技术问题，因此随着基因工程技术的发展人们开始对鼠源单抗的基因进行种种改造，目的在于尽量减少抗体中的鼠源成份，但保留原特异性。

　　我室成功地克隆了鼠源抗人纤维蛋白单克隆抗体重链和轻链可变区基因，表达的抗人纤维蛋白单链抗体(ScFv-8E5)具有特异性识别和结合人纤维蛋白的活性^〔2〕。我们将ScFv-8E5的重链(V_H)先行改造，改造后的Hu-V_H -ScFv8E5仍具有抗人纤维蛋白的活性。

材料与方法

　　1.人源化改造方案及其表达载体的构建：用计算机分析人免疫球蛋白数据库，寻找与V_H-8E5同源性高的人免疫球蛋白重链可变区序列，作为人源化改造的框架,植入V_H-8E5的CDRs，同时注意保留待改造序列中个别影响分子构象的氨基酸残基。设计序列长380bp左右，合成 18个 DNA小片段，然后将互补的正链和负链退火且磷酸化，用连接酶连接，再用NcoⅠ和HindⅢ切成粘性末端，纯化后插入经同样酶切且回收的pOPE101-8E5^〔2〕，构建出重组表达载体pOPE101-V_H-8E5，转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆用于表达。表达载体pOPE101-215由德国肿瘤研究中心Dubel博士提供。这个载体带有Lac启动子和果胶酶先导序列，调控其下游的抗果蝇melanogaster RNA聚合酶Ⅱ小鼠ScFv的表达，其3末端的C-myc短肽密码子可作为表达产物的标记，6个组氨酸密码子用于表达产物的纯化（图1）。

　　图1　重组的表达载体pOPE101-V_H-8E5

　　Fig 1.Restriction map of the recombinant expression vector pOPE101-V_H-8E5

　　2.DNA序列分析：选取酶切鉴定无误的阳性克隆，扩增后提取质粒DNA，用EcoRⅠ、HindⅢ切下Hu-V_H ，插入测序载体M13mp19的EcoRⅠ、HindⅢ酶切点，转化大肠杆菌JM109，再用X-gal和IPTG进行蓝白斑筛选。取酶切正确的阳性克隆，提取重组M13单链DNA为模板，用4种荧光标记的M13引物（ABI公司）按ABI公司提供程序进行双脱氧末端终止反应。用ABI370A型DNA序列分析仪测序。计算机收集数据，并用ABI公司提供的DNA序列分析软件对原始数据进行分析。

　　3.Hu-V_H-ScFv8E5的表达和纯化：测序正确的阳性克隆用LB_GA(含有50μg/ml氨苄青霉素、100mmol/L 葡萄糖的LB）培养过夜，次日1∶40倒入新鲜LB_GA ，待A600=0.8时加入终浓度20μmol/L IPTG诱导，室温表达3小时后收集菌体，加破壁液(50mmol/L Tris-HCl，20％蔗糖，1mmol/L EDTA,pH8.0）冰浴1小时，30　000×g离心40分钟，收集上清液中的可溶性蛋白，经透析后用IMAC柱一步纯化^〔3，4〕。

　　4.SDS-PAGE：100μmol/L IPTG诱导组菌体总蛋白用12％聚丙烯酰胺还原电泳，考马斯亮蓝染色后用激光扫描仪分析电泳区带的蛋白含量。

　　5. Hu-V_H-ScFv8E5与抗原的结合：用改进的酶联免疫吸附实验(ELISA)^〔2〕观察IMAC柱纯化Hu-V_H-ScFv8E5对纤维蛋白的抗体特异性识别。以ScFv-8E5为阳性对照。人纤维蛋白原包被96孔板，含15%牛血清白蛋白的DMEM活化抗原为纤维蛋白，纯化的ScFv为一抗，分泌抗C-myc单抗的9E10杂交瘤培养上清与ScFv的C-myc位点结合，辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG为二抗，四甲基联苯胺（TMB）作为底物。1mol/L H₂SO₄终止反应后，用酶标仪检测波长450nm处的光吸收值。

结果

　　1.合成DNA序列的鉴定和重组：合成的18个DNA小片段经连接酶连接后，在琼脂糖凝胶电泳上显示出380bp左右的带(图2)。电泳纯化后用NcoⅠ、HindⅢ酶切装入同样酶切的pOPE-101-8E5^〔2〕，转化大肠杆菌JM109。从筛选的阳性克隆中能检出预期大小的插入片段。

　　图2　合成DNA片段的连接产物

　　Fig 2. Ligation product of synthesized DNA fragments

　　M:DNA markers,Hu-V_H:Humanized heavy-chain variable domain of anti-fibrin ScFv-8E5

　　2.Hu-V_H的DNA序列分析及推断的氨基酸序列：选取酶切鉴定正确的阳性克隆作DNA序列分析，结果表明Hu-V_H的合成和连接符合预期设想。其人源DNA序列HUMHCH109选自Kabat database免疫球蛋白基因数据库和Tomlinson人免疫球蛋白可变区基因数据库，与V_H-8E5同源性71.8%，其三维结构分子模型与ScFv-8E5相似，通过逐个碱基比较，用鼠源V_H-8E5的CDRs取代HUMHCH109的相应CDRs，但保留影响表达产物三维结构的少数几个氨基酸（图3），设计出比较合理的人源化V_H-8E5 DNA序列。人源、鼠源免疫球蛋白第44位氨基酸多为Gly，Arg⁴⁴少见。当氨基酸残基位于CDR区域附近5埃以内时，一般参与CDR构象的形成^〔6〕。因此靠近CDR₂的Ile⁴⁸、Lys⁶⁷、Ala⁶⁸均保留原鼠源氨基酸残基。鼠源V_H-8E5 FRs中共改变了20个氨基酸。按照HUMHCH109重链可变区框架结构和鼠源V_H-8E5的CDRs大小，人源化V_H-8E5为120个氨基酸。

　　图3　人源化抗人纤维蛋白单链抗体重链可变区氨基酸序列

　　Fig 3. Deduced amino acid sequences of the humanized anti-fibrin ScFv-8E5 heavy chain

　　The amino acid sequence of the HUMHCH109 antibody heavy chain (upper lines) are shown aligned above the mouse anti-fibrin heavy chain (lower lines), with a“｜” indicating identity of amino acids. The three CDRs in each chain are underlined, and the other mouse amino acids used in the humanized ScFv are stars(*).

　　3. Hu-V_H -ScFv 8E5的表达： 100μmol/L IPTG诱导表达的产物经SDS-PAGE表明, Hu-V_H -ScFv 8E5相对分子质量约30×10³左右，与ScFv-8E5相近。激光扫描结果表明，Hu-V_H -ScFv 8E5表达带占细菌总蛋白的11.2%（图4）。从20μmol/L IPTG诱导组的周质腔提取可溶性ScFv，经IMAC柱一步纯化后ScFv 纯度达90% 以上^〔3，4〕。

　　图4　总蛋白的SDS-PAGE

　　Fig 4. SDS-PAGE of total cell extracts

　　M:Protein molecular weight markers; Lane 1. E.coli JM109 transfected with pOPE101-8E5 without iPTG; Lane 2. E.coli JM109 transfected with pOPE101-8E5 induced with 100μmol/L iPTG; Lane 3.E.coli JM109 transfected with pOPE101-V_H-8E5 without IPTG; Lane 4.E.coli JM109 transfected with pOPE101-V_H-8E5 induced with 100μmol/L; ←:Recombinant protein

　　4. Hu-V_H -ScFv 8E5对纤维蛋白的识别：IMAC柱一步纯化后的ScFv用ELISA检测与人纤维蛋白的结合，以ScFv-8E5为阳性对照，阴性对照用PBS代替ScFv。多批表达产物不同浓度的重复检测结果表明，人源化的重链可变区与尚未改造的轻链可变区匹配后，获得的Hu- V_H -ScFv 8E5有特异性结合人纤维蛋白的能力，是亲本抗体ScFv-8E5抗原亲和力的4/5（图5）。

　　图5　人源化ScFv-8E5的抗原结合力分析

　　Fig 5. Fibrin-binding analysis of humanized ScFv-8E5

讨论

　　鼠源性单抗用于临床治疗的最大障碍是其高免疫原性。因而应尽量减少抗体中的鼠源成份。第一步是去掉抗体的恒定区，留下必需的抗原结合单位——可变区；进一步再对可变区作人源化改造，即采用人免疫球蛋白可变区框架，添入决定抗原结合特异性的互补决定区氨基酸残基。用这种方法改造的抗体免疫原性低，又可保留甚至提高其抗原结合力。但是人源化改造后的抗体多数抗原结合力较低。为了保证改造后的抗体分子仍有类似改造前的分子构象，在选择人免疫球蛋白可变区框架时，应尽可能挑选与待改造序列同源性高的人源序列，同时注意保留待改造序列中个别影响分子构象的氨基酸残基^〔7〕。紧靠CDR的氨基酸一般不宜改动。 一般来说，抗体的亲和力 、特异性决定于重链和轻链可变区二者的结构，但是有些抗体在很大程度上依赖于重链可变区，轻链可变区的作用略弱一些^〔7〕。鼠源ScFv-8E5的重链可变区与一无关抗体的轻链可变区(V_L-215)匹配后,表达产物仍具有纤维蛋白结合特异性^〔2〕。表明ScFv-8E5的重链可变区对其特异性结合人纤维蛋白的功能起决定性作用，因此人源化的重点在于V_H -8E5。

　　对鼠源性抗人纤维蛋白单链抗体的可变区V_H -8E5作人源化改造，获得了仍有原抗原结合特异性的人源化ScFv，说明V_H-8E5的人源化改造基本上获得了成功。下一步采用点突变技术提高抗原结合活性，同时对V_L-8E5亦作人源化改造，获得有高活性的人源化抗人纤维蛋白ScFv。ScFv的相对分子质量小(仅为完整抗体分子的六分之一)，免疫原性低，组织穿透力强，体内清除快。ScFv本身不会引起全抗体的生物学效应，但可以利用其抗原结合特异性把其它效应分子带到靶位^〔8〕。人源化的抗人纤维蛋白ScFv可以标记上放射性核素，定位诊断深部血栓；亦可以将溶栓剂导向血栓，增强了溶栓剂的特异性，减少毒副作用，有很好的应用前景。

　　参考文献

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(收稿：1998-04-06　　修回：1998-06-29)