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编码人分化抗原5C5全长cDNA的克隆及功能初探
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第3期第20卷 基础免疫学
作者：马凤蓉 阎民 孟晓燕 赵方萄 汪邁 史耕先 刘音 王讯 朱立
单位：中国医学科学院基础医学研究所, 中国协和医科大学免疫学教研室
关键词：5C5 cDNA；亮氨酸拉链蛋白；B淋巴细胞；分化抗原
【 摘要 】 目的 编码5C5分化抗原全长cDNA的克隆及功能探索。 方法 构建人活化B细胞株3D5细胞的λgt11 cDNA文库，以核苷酸杂交法从cDNA文库中筛选阳性克隆，作核苷酸序列分析，编码蛋白质氨基酸序列的亲疏水分析，Northern blot测5C5 mRNA转录本长度，用RT-PCR检测5C5 mRNA在不同细胞株的表达，观察单抗5C5-G1对3D5细胞增殖的影响。 结果 从人活化B细胞株3D5的λgt11 cDNA文库筛选到长905bp的5C5-1 cDNA及754bp的5C5-2 cDNA。5C5-1 cDNA序列内有1个开放阅读框架(19～537bp)，编码179个aa的蛋白质。此蛋白质内有一穿膜螺旋结构（94～114aa）, 其N端在胞内。5C5-2 cDNA从163到459为开放阅读框架，编码99个aa的蛋白质。从Northern blot见0.9kb左右和0.7kb左右2条杂交带。由RT-PCR见5C5 mRNA在3D5细胞强表达，在Daudi细胞表达次之，在Jurkat细胞表达最弱。单抗5C5-G1有增强cpBCGF诱导3D5细胞增殖的作用。 结论 长905bp的5C5-1 cDNA为1个全长cDNA。编码1个膜蛋白，可能参与3D5细胞的增殖反应。
Cloning and sequencing of the cDNA encoding a
human differentiation antigen
MA Fengrong, YAN Min, MENG Xiaoyan, et al. Department of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, and Basic Medical College, Peking Union Medical College, Beijing 100005, P.R.China
【 Abstract 】 Objective Cloning and sequencing of the cDNA encoding a differentiation antigen 5C5. Methods Construction of a λgt11 cDNA library of 3D5 cells, a human activated B cell line; isolation of positive cDNA clones from the cDNA library with phage hybridization; sequencing of the cDNA; open reading frame analysis; hydrophobic analysis of the amino acid sequence of the deduced protein; determination of the length of 5C5 mRNA transcript with Northern blot hybridization test; determination of 5C5 mRNA transcription in various cell lines with RT-PCR. Results 5C5-1 cDNA (0.9kb) and 5C5-2 cDNA (0.7kb) have been isolated from a λgt11 cDNA library of 3D5 cell, a human activated B cell line, by using a 467bp 5C5 cDNA as a probe. Nucleotide sequence analysis has shown that the 5C5-1 cDNA is 905bp long with an open reading frame (ORF) from 19 to 555bp in it. The TopPred 2 topology prediction of the membrane protein suggests that the 179aa protein deduced from the ORF has a helix membrane-spanning segment from 94 to 114aa. The orientation is that the N-terminal is inside the cell. 5C5-2 cDNA is 754bp long with an ORF from 163 to 459bp encoding a protein with a length of 99aa. Northern blotting shows two mRNA transcripts with lengths of 0.9kb and 0.7kb respectively, indicating that the 905bp cDNA is a full-length cDNA. RT-PCR reveals strong, medium and weak expressions of 5C5 mRNA in 3D5 cell, Daudi cell and Jurkat cell respectively. Conclusion The 905bp 5C5-1 cDNA is a full-length cDNA encoding a human membrane protein.
【 Subject words 】 5C5 cDNA; Leucine-zipper protein; B lymphocyte; Differentiation antigen
我们曾报道，用抗人活化B细胞株3D5的单克隆抗体5C5〔1〕和5C5-G1〔2〕的混合物，从人扁桃体细胞λgt11 cDNA文库(ATCC, Cat No:37545)筛选到1个长613bp的cDNA〔3〕。由于其长度与以往作的Northern blot检测结果不符，我们以已克隆到的cDNA作探针，从相应cDNA文库再作克隆。从所构建的3D5细胞λgt11 cDNA文库，克隆到905bp(5C5-1)和754bp(5C5-2)长的2个cDNA。在5C5-1 cDNA中有一个开放阅读框架（19～555bp），编码179个氨基酸(aa)的膜蛋白。在5C5-2 cDNA中有一个长297bp(163～459bp)的开放阅读框架，编码99个aa的蛋白质。单抗5C5-G1有增强BCGF（B细胞生长因子）诱导3D5细胞增殖的作用。
材料与方法
细胞与菌株：人活化B细胞株由本室建立〔4〕。人Burkitt淋巴瘤细胞株Daudi及人T淋巴瘤细胞株Jurkat冻存于本室。所有细胞均于含10%初生牛血清、2mmol/L 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中培养传代。大肠杆菌Y1090和DH5α为本室保存。
工具酶、试剂盒及同位素：限制性内切酶购自Promega公司及GIBCO公司。T4 DNA连接酶、Klenow大片段酶、M-MLV逆转录酶等购自Boehringer Mannheim公司。RNase A、DNase Ⅰ及蛋白酶购自华美生物制品公司。总RNA提取试剂盒、mRNA提取试剂盒、随机引物标记试剂盒及λ噬菌体包装蛋白购自Promega公司。cDNA合成试剂盒购自Pharmacia公司。小量胶回收试剂盒产自上海华顺生物试剂公司。α-32P-dCTP购自北京亚辉生物医学工程公司。低分子质量BCGF由本实验室制备〔5〕。
3D5细胞λgt11 cDNA文库的构建：收集生长状态良好的3D5细胞约108，用PBS于4℃离心洗涤1次，按总RNA提取试剂盒说明提取总RNA。mRNA的分离纯化、cDNA一、二链的合成，双链cDNA末端EcoRⅠ接头的连接及双链cDNA的重组与包装均按照相应试剂盒说明书操作。按1100、 11000、110000比例稀释噬菌体包装混合物，感染Y1090大肠杆菌，计算噬菌体cDNA文库滴度与cDNA文库的重组率。提取随机挑选的白色噬菌斑的重组噬菌体，用EcoRⅠ限制性内切酶消化，电泳鉴定插入片段大小。扩增cDNA文库，加入终浓度为7%的二甲基亚砜，储存于-70℃。具体方法参照“Molecular Cloning”〔6〕。
3D5细胞λgt11 cDNA文库筛选：探针按Promega公司随机引物标记试剂盒操作说明标记α32P-dCTP。筛选方法参照“Molecular Cloning”。将λ噬菌体噬斑固定于尼龙膜(GIBCO BRL)。杂交，洗膜后压片，于-70℃曝光24～48小时。按照X光片上阳性点的位置寻找阳性噬斑。挑取阳性噬斑，置于SM液中扩增噬菌体。连续几轮筛选，直至平板上噬斑全部阳性。
阳性λ噬菌体克隆DNA的提取及DNA核苷酸序列测定：参照“Molecular Cloning”介绍的方法提取阳性重组噬菌体DNA。用EcoRⅠ酶小量酶切消化。电泳观察阳性克隆插入片段大小。挑取不同大小插入片段，插入pGEM-3Z（+）质粒。扩增及提取质粒。在美国PE公司生产的377型DNA测序自动分析仪上，用荧光标记引物循环测序法行测序反应。
cDNA核苷酸序列与其编码蛋白质氨基酸序列的计算机分析：用DNAsis软件分析cDNA序列中的开放阅读框架。用Prosis蛋白分析软件对所演绎的蛋白质作亲疏水分析。从Internet网上以blast方式与GenBank数据库资料比较所得蛋白质氨基酸序列的同源性。用TMpred软件预测蛋白质的穿膜区。用MotifFinder软件预测5C5蛋白质中的基本序列（motif）。
Northern blot杂交分析：取所提的3D5细胞RNA，行RNA甲醛变性凝胶电泳。将凝胶中的RNA转印至尼龙膜。室温晾干（30min）后，置于两张滤纸间，于真空干燥器中80℃烘干2h。以α32P-dCTP标记的467bp 5C5 cDNA作探针行Northern杂交。杂交尼龙膜洗涤后用滤纸吸干，保鲜膜包裹，-70℃压片显影。数天后冲洗X光片。方法参照“Molecular Cloning”。
RT-PCR：提取3D5细胞、Daudi细胞和Jurkat细胞的总RNA。依测得的5C5 cDNA核苷酸序列合成上下游引物（上游引物1：5′GGA TAA CGC CCC CAA GGA G3′，下游引物1：5′CTT TGG CGA CAT TGG CTT TG 3′；上游引物2：5′ACC TCG TCC AGG CAA AGA AGC 3′；下游引物2：5′ATT CTC CCA AAC GGC TCC AC 3′），并合成β-actin上下游引物5′GAT GAT ATC GCC GCG CT 3′和5′TGG GTC ATC TTC TCG CGG TT 3′。向经DEPC水处理的Eppendorf管中加入DEPC水15μl、5×反转录酶缓冲液6μl、dNTP (10mmol/L) 1μl、poly T16 (50μmol/L)1μl、寡聚六核苷酸1μl与总RNA 1.5μg。混匀后置65℃水浴10min以变性RNA。置冰浴2min，转入42℃ 10min，再加入RNasin(10U/μl) 0.5μl、100mmol/L DTT 3μl与鼠源性反转录酶M-MLV (200U/μl)1μl，混匀。于42℃水浴90min后行PCR扩增。依次加入纯净水35μl、10×Taq缓冲液5μl、dNTP (10mmol/L)4μl、上游引物1（10μmol/L）1μl（或上游引物2）、下游引物1（10μmol/L）2μl（或下游引物2）、25mmol/L MgCl2 2μl及Taq酶4U。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃～60℃退火45s（依引物中G+C含量不同而改变退火温度），72℃延伸1min，循环35次，最后再72℃延伸5min。取10μl PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察结果。设β-actin为内参照。
3D5细胞的增殖： 用RPMI 1640液离心洗涤3D5细胞2次，并用此液重悬3D5细胞，密度为106/ml。加1ml细胞悬液于50ml无菌离心管内，1500r/min离心50min，弃上清。然后分别加入100μl用RPMI 1640稀释的5% 5C5-G1单抗腹水，或5% Sp2/0腹水，或RPMI 1640，置冰浴1h。用RPMI1640液1500r/min离心洗涤细胞1次。再用RPMI 1640液重悬细胞，密度为2.5×104/ml。向96孔板加180μl细胞悬液。每孔各加10μl BCGF（终浓度为5%），对照孔加10μl RPMI 1640。37℃ 5% CO2孵箱中培养24h，收获前8h加3H-TdR，每孔18.5kBq(0.5 μCi)/20μl，用细胞收获仪收集细胞，液闪仪计数测cpm值。
结果
1.3D5细胞λgt11 cDNA文库鉴定：依不同稀释度时噬菌斑形成的数目，计算所构建的3D5细胞cDNA文库的滴度（表1）。
表1 重组3D5细胞噬菌体文库的滴度
Table 1. The titer of the recombinant λ phage clones of 3D5 cells
| Dilution | Plaque number | Titer(PFU/ml) |
| 1100 | 1200 | 1.2×106 |
| 11000 | 109 | 1.09×106 |
| 110000 | 10 | 1.0×106 |
根据形成的蓝白噬菌斑数目和总噬菌斑的数目，计算出所建cDNA文库的重组率为97.5%。随机提取的白噬菌斑的噬菌体DNA，用EcoRⅠ酶切，电泳。估计所建的cDNA文库插入片段的大小在0.4～2.5kb之间，平均约为1.6kb。
2. 5C5 cDNA的克隆：用以往筛选的613bp 5C5 cDNA的前467bp核苷酸序列作探针。从所构建的3D5细胞λgt11 cDNA文库筛选到了17个阳性克隆。所提取的13个噬菌体DNA经EcoRⅠ酶切，电泳鉴定，见其中一些克隆的插入片段长0.9kb左右，另一些克隆的插入片段长0.7kb左右。5C5-1 cDNA与5C5-2 cDNA 5′端点12个bp相同，5C5-2 cDNA的13～746bp与5C5-1 cDNA的165～908bp相同。5C5-2 cDNA缺失5C5-1 cDNA中13～164bp的核苷酸序列。
3. 5C5 cDNA序列测定：5C5-1 cDNA全长905bp，包括18bp的5′非编码区，从19至555bp间537bp构成一个完整的开放阅读框架，编码179个aa组成的蛋白质。终止密码子TGA后有368bp的3′非编码区，有Poly A尾巴，但未见加尾信号（图1）。5C5-2 cDNA全长754bp，5′非编码区长162bp，从163到459bp间为开放阅读框架，编码99个aa的蛋白质。终止密码子后有长295bp的3′端非编码区及Poly A尾巴（图2）。
4. 5C5-1 cDNA编码蛋白质的计算机分析：经blast方式与GenBank数据库作比较，见5C5-1 cDNA编码蛋白质的1～154aa与Mitochondrial 60S ribosomal protein L7/L12 (SP|P2815|RM12 Human)的1～154aa（全长199aa）的同源性达82%。5C5-1 cDNA编码蛋白质氨基酸序列中有1个明显的疏水区（图3）。穿膜分析预测94～114aa为一穿膜螺旋结构，N-端在胞内。MotifFinder 分析见此蛋白质N端2～23aa为一亮氨酸拉链结构，75～78aa为1个酪蛋白激酶磷酸化位点，89～91aa、131～133aa及158～160aa为3个蛋白激酶C磷酸化位点，144～152aa为1个酪氨酸激酶磷酸化位点，171～174aa为1个N-糖基化位点，15～20aa、101～106aa、106～107aa及106～111aa为4个肉豆蔻酰基化位点。此蛋白无信号肽结构，相对分子质量约为19587.81，pI9.73。
| 图1 5C5-1 cDNA核苷酸序列及所演绎的蛋白质的氨基酸序列
Fig 1. The nucleotide sequence of 5C5-1 cDNA and the amino acid sequence of the deduced protein from the open reading frame |
图2 5C5-2 cDNA核苷酸序列及所演绎的蛋白质的氨基酸序列
Fig 2. The nucleotide sequence of 5C5-2 cDNA and the amino acid sequence of the deduced protein from the open reading frame
图3 5C5-1 cDNA编码蛋白质氨基酸序列的亲疏水分析
Fig 3. Hydrophobic analysis amino acid sequence of 5C5-1 cDNA encoded protein
5. Northern blot杂交分析：用475bp长核苷酸作探针行杂交，见3D5细胞mRNA有长约0.9kb与0.7kb两个转录本（图4）。
图4 5C5 mRNA的Northern blot分析
Fig 4. Northern blot analysis of 5C5 mRNA
6. 不同淋巴细胞株的mRNA转录：用两对引物作RT-PCR检测均显示，人B细胞株3D5细胞5C5 mRNA转录最强，勃氏淋巴瘤细胞Daudi细胞次之，T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞最弱（图5）。
7. 单抗5C5-G1对3D5细胞增殖的影响：cpBCGF能诱导3D5细胞增殖。单抗5C5腹水与3D5细胞在冰浴中预育1h，对3D5细胞在cpBCGF诱导下的增殖反应有增强作用。对照腹水Sp2/0无此作用（表2）。
图5 RT-PCR检测5C5 mRNA在不同细胞株的表达
Fig 5. RT-PCR detection of 5C5 mRNA in various cells line
表2 单抗5C5-G1对BCGF诱导3D5细胞增殖的增强作用
Table 2. Enhancement of BCGF-driven proliferation of 3D5 cells by McAb 5C5-G1
| BCGF
(5%) |
Sp2/0
ascites(5%) |
5C5-G1 McAb
ascites(5%) |
3 H-TdR(cmp×1000) | |
| Exp 1 | Exp 2 | |||
| - | - | - | 1050±215 | 1023±196 |
| + | - | - | 4380±350 | 4510±426 |
| + | + | - | 5010±780 | 3890±840 |
| + | + | + | 9600±642 | 8594±728 |
讨论
5C5 cDNA是本实验室用单抗5C5和单抗5C5-G1的混合物从一个人扁桃体细胞λgt11 cDNA文库(ATCC No.37545)筛选到的，长613bp〔3〕。由于以往所作的Northern blot检测结果不明确，不能判断所筛选到的cDNA是否为全长，故本实验以613bp cDNA为基础，再行筛选。我们首先用613bp cDNA作探针，从另一个人扁桃体细胞λgt11 cDNA文库(ATCC No.37546)作Southern blot筛选。但所有噬菌斑均显现阳性信号。在与GenBank数据库作同源性分析中发现，此613bp cDNA 3′端的139bp序列与大肠杆菌E.coli基因组DNA中一段核苷酸序列完全相同。筛选中的全阳性信号就是由它引起的。人扁桃体细胞λgt11 cDNA文库是用手术切除慢性炎性扁桃体细胞构建的。尽管手术标本用含抗菌素的培养液作了清洗，但很可能未彻底清除标本中的细菌，包括E.coli。在文库构建中，细菌DNA的某些片段可能与扁桃体细胞cDNA一起，插入λgt11两臂间。在613bp cDNA 5′端467bp与3′端139bp间存在一个EcoRⅠ酶切位点，表明5′端467bp的扁桃体细胞cDNA与3′端139bp E.coli cDNA片段是藉EcoRⅠ酶切位点相连，一起插入λgt11两臂间的。这应当引起藉DNA杂交筛选扁桃体文库的注意。
在去除3′端139bp后，用5′端467bp cDNA作探针，再筛选扁桃体细胞cDNA文库(ATCC No.37546)。但是，只筛选到一个长467bp的阳性克隆。其核苷酸序列与467bp探针相同。在以往用单抗5C5和单抗5C5-G1的混合物从人扁桃体细胞cDNA文库(ATCC No.37545)的筛选中，得到了3个阳性克隆。2个均长467bp，序列完全相同，就是本实验筛选中所用的467bp探针序列。另一个克隆613bp长，但其5′端467bp与本实验所用467bp 探针序列完全相同，其3′端139bp为E.coli DNA序列片段〔3〕。这使我们怀疑，在人扁桃体细胞λgt11 cDNA文库中是否只存在467bp长的 5C5 cDNA。
613bp 5C5 cDNA是用单抗5C5与单抗5C5-G1的混合物筛选到的。单抗5C5是用3D5细胞免疫小鼠，并以3D5细胞为靶细胞筛选得到的〔1〕。单抗5C5-G1是用单抗5C5亲和层析所得3D5细胞膜蛋白提取物免疫小鼠，并以3D5细胞作靶细胞得到的〔2〕。它们均与3D5细胞有明显的阳性反应。因此，我们构建了3D5细胞的λgt11 cDNA文库，并用467bp 5C5作探针，用Southern blot方法筛选了这个文库，得到了17个阳性克隆。其中一部分克隆长0.9kb左右，另一部分长0.7kb左右。0.9kb左右的克隆测序得905bp长的cDNA，称5C5-1 cDNA。0.7kb左右的克隆测序得754bp长的cDNA，称5C5-2 cDNA。5C5-1 cDNA与5C5-2 cDNA 5′端的12个碱基相同，但5C5-2 cDNA缺失了5C5-1 cDNA中18～164bp序列。5C5-1 cDNA从165bp后的序列与 5C5-2 cDNA从19bp后的序列相同。5C5-1 cDNA、5C5-2 cDNA与467bp 5C5 cDNA可能系同一基因变位剪切(alternative splicing)的产物，即来自一个基因的RNA前体可通过不同剪切而生成多个mRNA。它们翻译出不同相对分子质量的蛋白质。如CD22分子的α和β链即为同一RNA前体经不同剪切而产生的〔7〕。
Northern blot分析观察到，3D5细胞有0.9kb左右和0.7kb左右两条RNA杂交带。这与5C5-1 cDNA及5C5-2 cDNA的长度相符。这表明5C5-1 cDNA是一个全长cDNA。
在同源性比较中，观察到5C5-1 cDNA编码蛋白质的1～154aa与线粒体60S核糖体蛋白L7/L12的1～154aa高度同源。但后者表达于G1期纤维细胞株CCL39的线粒体，而不表达于胞膜〔8〕。我们用单抗5C5-G1作间接免疫荧光染色观察到，单抗5C5-G1识别的分化抗原表达于3D5细胞的胞膜与近膜胞浆处〔9〕。从RT-PCR见5C5 mRNA在3D5细胞强表达，在Daudi细胞表达次之，而在Jurkat细胞则弱表达。这与用单抗5C5-G1免疫荧光染色流式细胞仪分析结果是一致的〔2〕。另外，人扁桃体组织免疫组化染色观察到，单抗5C5-G1识别的蛋白主要表达于生发中心细胞，而淋巴滤泡周边细胞及滤泡间细胞则为阴性〔10〕。TMpred软件蛋白质穿膜分析提示，5C5 cDNA编码蛋白质是一个膜蛋白，其N端在胞内。另外，这个蛋白质N端2～23aa为一亮氨酸拉链结构。
3D5细胞表面有高亲和力（KD=2.77×10-12mol/L，每个细胞有1.44×103个受体位点）和低亲和力（KD=5.73×10-10mol/L, 每个细胞有1.97×104个受体位点）两类低分子质量B细胞生长因子受体〔10〕。3D5细胞的生长需自身分泌的生长因子的刺激。培养中低密度3D5细胞的生长需要外源性生长因子的存在〔5〕。单抗5C5-G1对BCGF诱导下3D5细胞增殖的增强作用表明，单抗5C5-G1识别的分化抗原参与3D5细胞的增殖反应。5C5-1 cDNA编码的蛋白质的基序预测也显示，它可能在信号转导中发挥作用。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39630300)
本文报道的cDNA已在GenBank登记,登记号为U25041(5C5-1)与AF105278(5C5-2)
参考文献
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(收稿日期：1999-06-21)