重组人IL-18和IL-18-GFP融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

重组人IL-18和IL-18-GFP融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第4期第19卷 细胞因子

作者：胡晓　吕平　王丽峰　M. M. Chilvers　高晓明

单位：100083 北京医科大学免疫学系(胡晓 吕平 高晓明)；解放军463医院三内科(王丽峰)；英国，帝国理工医学院生物化学系(M.M.Chilvers)

关键词：白细胞介素18；绿色荧光蛋白；融合蛋白；IFN-γ诱导因子

　　【 摘要 】　目的　在大肠杆菌中表达重组人IL-18（rhIL-18）及rhIL-18-绿色荧光蛋白 (GFP)融合蛋白并测定其生物活性。方法　构建原核表达质粒pET28a/hIL-18及pTrc99/hIL-18-GFP，并分别转化大肠杆菌BL21。用IPTG诱导重组蛋白的表达，超声裂菌上清中的rhIL-18用镍金属螯合层析柱进行纯化，rhIL-18-GFP用抗GFP亲和层析柱及Sephacryl S-100分子筛柱纯化。以人的外周血单核淋巴细胞测定两重组蛋白的生物活性。结果　表达的rhIL-18及rhIL-18-GFP均具有促进T细胞增殖，增强NK细胞细胞毒作用及诱导外周血单核淋巴细胞合成IFN-γ的能力, rhIL-18-GFP还具有GFP的绿色荧光特性, 可对P815细胞进行标记。结论　表达并纯化的rhIL-18及rhIL-18-GFP具有生物活性，可用于进一步的功能研究。

　　Expression and analysis of recombinant human IL-18 and human IL-18-GFP fusion protein　HU Xiao^*, WANG Lifeng, LU Ping, et al. ^*Department of Immunology, Beijing Medical University , Beijing 100083

　　【 Abstract 】　Objective　Interleukin 18 (IL-18), also known as IFN-γ-inducing factor, shares certain functional properties with IL-12. To study the biologic activities and receptor distribution of recombinant human IL-18 and IL-18-GFP fusion protein expressed in E. coli.Methods　Two prokaryotic expression plasmids, pET28a/hIL-18 and pTrc99/hIL-18-GFP have been constructed to express the recombinant human IL-18 (rhIL-18) and its fusion protein with green fluorescent protein (GFP) in E. coli BL21, respectively. rhIL-18 was tagged with six histidine residues at its C terminus and was purified by nickel chelation chromatography. rhIL-18-GFP was purified with anti-GFP affinity chromatography and gel filtration. Biological activities were assayed with human peripheral blood mononuclear cells (PBMC).Results　Preliminary studies showed that rhIL-18-GFP as well as rhIL-18 augmented T cell proliferation and IFN-γ production by ConA-stimulated human PBMCs, and enhanced NK cell cytotoxicity. In addition, rhIL-18,GFP has shown specific binding to P815 cells and the stained cells could be analyzed with flow cytometry.Conclusions　The rhIL-18 and rhIL-18-GFP we prepared are functional and can be applied to further studies on human IL-18.

　　【 Subject words 】　Interleukin 18　　Green fluorescent protein　　 Fusion protein

　　白细胞介素18 (IL-18 ) , 又称IFN-γ诱导因子 (IGIF), 是最近发现的一种细胞因子,主要由活化的巨噬细胞产生。其生物学活性与IL-12相似，能促进T细胞增殖，诱导T细胞分泌IFN-γ、GM-CSF，抑制IL-4和IL-10产生，增强NK及T_H1细胞的细胞毒活性等；IL-18的表达还与自身免疫病、肿瘤及感染有关^〔1，2〕。绿色荧光蛋白 (GFP) 来源于发光生物——维多利亚水母，由238个氨基酸残基组成，经490nm波长激光激发发出绿色荧光，其激发光及发射光光谱与异硫氰酸荧光素(FITC)很接近，GFP作为分子标签已广泛地应用于分子及细胞生物学的研究 ^〔3〕　　 。

　　我们构建了人IL-18（hIL-18）及hIL-18与GFP的融合蛋白 (hIL-18-GFP) 原核表达质粒，并在大肠杆菌中获得表达。经镍金属螯合层析纯化rhIL-18，经抗GFP亲和层析及Sephacryl S-100分子筛层析纯化rhIL-18-GFP后，用人的外周血单核淋巴细胞（PBMC）测定了纯化的重组蛋白生物活性。

　　材料与方法

　　1.质粒、引物及表达质粒的构建：原核表达质粒pET28a和pTrc99均购自Novagen公司，GFP表达质粒由英国帝国理工医学院L.Barber博士惠赠。构建hIL-18表达质粒所用5＇和3＇端引物分别为：5＇-gttc

　　抽取健康人外周静脉血分离PBMC，提取总RNA，以oligo dT为引物进行RT-PCR得到cDNA。以该cDNA为模板用相应引物扩增IL-18 cDNA,并将所得PCR产物克隆于pET28a，构建成表达质粒pET28a/hIL-18。 通过三步PCR法获得编码IL-18-GFP融合蛋白的DNA片段。方法为：以IL-18 cDNA为模板，用引物 (a) 和 (b) 进行PCR扩增编码IL-18第37～193位氨基酸残基的cDNA片段， 电泳纯化第一步PCR产物。第二步,以表达GFP的质粒为模板，用引物 (c) 和 (d) 扩增编码GFP的DNA片段并纯化第二步PCR产物。第三步将第一步和第二步PCR产物混合作为模板，用引物 (a) 和 (d) 进行扩增得到编码IL-18-GFP融合蛋白的DNA片段。电泳回收此PCR产物，酶切后克隆于表达质粒pTrc99之中，构建成pTrc99/hIL-18-GFP。构建的表达质粒示意图见图1。

图1　pET28a/hIL-18及pTrc99/hIL-18-GFP质粒构建

　　Fig 1. Construction of expression plasmid pET28a/hIL-18 and pTrc99/hIL-18-GFP

　　2. 菌株及细胞:所用表达菌株为E.coli BL21 (DE3)。外周血单核淋巴细胞用健康人外周静脉血经Ficoll-Hypaque（上海生化试剂厂）分离制备。人白血病细胞株K562及鼠肥大细胞瘤细胞株P815，用完全RPMI 1640-10％FCS培养基培养。

　　3. 试剂:ConA 、OPD、PMS、NBT、NAD、dNTP购自Sigma公司,Taq酶、T4连接酶、各种限制性内切酶购自Promega公司，IPTG购自Boehringer Mannheim公司，rhIFN-γ, 鼠抗人IFN-γ单抗（NIB42）及生物素标记的鼠抗人IFN-γ单抗 (4S.BS) 购自Pharmingen公司， 辣根过氧化物酶（HRP）标记链亲和素购自DAKO公司， rhIL-2由北京医科大学分子免疫室提供，His Bind Resin螯合层析填料购自Novagen公司，Sephacryl S-100及溴化氢活化的Sepharose CL4B购自Pharmacia公司。

　　4.重组蛋白的诱导表达:感受态细胞制备及质粒转化按常规CaCl₂法^〔4〕，转化后细菌用含相应抗生素的LB平皿筛选。挑取转化平皿上的单菌落接种于加有相应抗生素的LB培养基中。经37℃摇床培养扩增至吸光度A600为0.3～0.4时, 加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，30℃诱导表达12～18小时，离心收集细胞，15% SDS-PAGE分析。

　　5.rhIL-18的纯化:经诱导表达后的细菌用超声缓冲液(5mmol/L咪唑,0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris-Cl，pH7.9 ) 重悬后超声裂解菌体, 10　000r/min离心10分钟, 收集上清,采用NiSO₄饱和的His Bind Resin纯化。洗脱蛋白经TBS(pH7.4 )透析脱盐，用于纯度及活性分析。

　　6.rhIL-18-GFP纯化:经诱导表达后的细菌用TBS(pH8.0)缓冲液重悬后超声裂解菌体,10　000r/min离心10分钟,上清与偶联抗GFP多抗的Sepharose CL-4B亲和层析填料混匀, 4℃结合1小时后, 装柱用TBS(pH8.0)缓冲液充分洗去不结合的杂蛋白后,再用盐酸-甘氨酸缓冲液(pH3.0)洗脱与抗体结合的蛋白。收集的洗脱蛋白用TBS(pH8.0)缓冲液透析平衡后上样于Sephacryl S-100分子筛层析柱, 用TBS (pH8.0) 缓冲液洗脱。SDS-PAGE分析分子筛层析洗脱各峰的成分。

　　7. 热原质的去除:热原质去除采用亲和填料Polymyxin B Sepharose 4B^〔5〕， 热原测定采用鲎试剂（厦门鲎试剂厂）。

　　8.PBMC增殖试验:在96孔板上用完全RPMI 1640-10% FCS培养基按10倍稀释法稀释两组rhIL-18、rhIL-18-GFP和GFP，每个稀释度3个平行孔。分离的PBMC用完全RPMI 1640-10% FCS培养基配成4×10⁶细胞/ml, 分成两份, 对应稀释好的两组rhIL-18、rhIL-18-GFP和GFP，其中一份加入终浓度为0.05μg/ml的ConA。 在已稀释好的96孔板中每孔加入细胞100μl, 37℃ 5％CO₂孵箱培养72小时，最后8小时每孔加入³H-TdR 0.5μCi(18.5kBq)。收获细胞，用β液闪计数器测cpm值。

　　9.IFN-γ诱导合成试验:在96孔板上用完全RPMI 1640-10% FCS培养基按10倍稀释法稀释两组rhIL-18、 rhIL-18-GFP和GFP，每个稀释度3个平行孔。分离的PBMC用完全RPMI 1640-10% FCS培养基配成10⁶细胞/ml,分成两份,对应稀释好的两组rhIL-18、rhIL-18-GFP和GFP，其中一份加入终浓度为10U/ml的rhIL-2。然后在已稀释好的96孔板中每孔加入细胞100μl, 37℃ 5％CO₂ 孵箱培养48小时。收集细胞上清，用ELISA测定IFN-γ含量。

　　10.NK细胞细胞毒活性:分离的PBMC用含有或不含rhIL-2 (10U/ml) 完全RPMI 1640-10% FCS培养基分别加入rhIL-18， rhIL-18-GFP或GFP后, 37℃ 5％CO₂孵箱培养24小时。收细胞,用完全RPMI 1640-10% FCS培养基洗3次, 配成4×10⁶细胞/ml作为效应细胞。K562用完全RPMI 1640-10% FCS培养基配成4×10⁵细胞/ml作为靶细胞。在96孔U型板中每孔分别加入效应细胞及靶细胞各100μl，混匀，37℃ 5％CO₂孵箱孵育12小时，收上清，测上清中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。

　　11.ELISA法测IFN-γ含量:酶标板包被, 封闭及检测按常规双抗夹心法。用2μg/ ml鼠抗人IFN-γ单抗包被, 1％BSA封闭，二抗用1μg/ml生物素标记的鼠抗人IFN-γ单抗, HRP酶标链亲和素使用时按1∶5　000稀释。以OPD为显色底物，显色20～30分钟后，加2mol/L H₂SO₄终止酶促反应，用Bio-rad 450型酶标仪读A490nm值。同时以rhIFN-γ做平行实验，制作标准曲线，计算样品中的IFN-γ含量。

　　12.LDH释放法:参见文献〔6〕。

　　靶细胞裂解率 (％) ＝(OD效应细胞＋靶细胞－OD靶细胞自发释放）/ (OD靶细胞最大释放－OD靶细胞自发释放）×100

　　13．流式细胞术分析IL-18-GFP对细胞染色结果：培养的P815细胞离心收集后用新鲜的完全1640-10%FCS 培养基配成10⁶细胞/ml浓度，按10⁶细胞分别加入40μg GFP 和80μg IL-18-GFP，37℃标记2小时，用PBS（pH7.4）洗3次，用B-D FACScan 流式细胞仪检测。

　　结　果

　　1.rhIL-18及rhIL-18-GFP的表达与纯化：设计表达的rhIL-18从N端第32 位氨基酸残基至第193 位，其C端加有6个组氨酸，相对分子质量预测为22×10³。重组工程菌经IPTG诱导12～18小时后，表达的rhIL-18以包涵体和可溶性分子两种形式存在于菌体中。超声裂解细菌后取离心上清过滤，然后用镍金属螯合层析纯化（图2）。根据SDS-PAGE分析, 表达的rhIL-18相对分子质量与预测一致， 纯化后rhIL-18的蛋白纯度＞95%。

图2　rhIL-18的表达和纯化分析

　　Fig 2. Analysis of pET28a/rhIL-18 cxpression and rhIL-18 purification

　　1.Protein MW standard; 2.Lysate of BL21(pET28a/rhIL-18)before induced by iPTG; 3.Lysate of BL21(pET28a/rhIL-18)after induced by IPTG;4.Supernantant of BL21(pET28a/rhIL-18)after sonication; 5.Pellet of BL21(pET28a/rhIL-18)after sonication; 6-8.Nickel chelation chromatography of rhIL-18 by His-Bind Resin; 8.Purified rhIL-18

　　表达的rhIL-18-GFP为一个融合蛋白，从IL-18第37位至193位氨基酸残基通过甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸接头与GFP 连接（图1）, 完整的rhIL-18-GFP相对分子质量大约为50×10³。由于尚不明确的原因，纯化的rhIL-18-GFP中有约50%发生自发降解释放GFP，经亲和层析和分子筛层析两步纯化后, 得到的是rhIL-18-GFP与GFP混合体系。因此，在后续的生物学功能实验中均以纯化的GFP作为对照 (图3，图4）。用此纯化的rhIL-18-GFP标记P815细胞，胞膜表面的绿色荧光在荧光显微镜下清晰可见（未显示结果），并可用流式细胞计数仪对被染细胞及对照组进行定量分析（图5)。

图3　rhIL-18 -GFP的Sephacryl S-100分子筛层析 　　Fig 3. Sephacryl S-100 gel filtration chromatography of rhIL-18-GFP

图4　rhIL-18-GFP融合蛋白纯化分析

　　Fig 4. Analysis of rhIL-18-GFP purification on SDS-PAGE

　　1.rhIL-18-GFP purified with anti-GFP affinity chromatography; 2-5.Fractions of rhIL-18-GFP with gel filtration,peak 1; 6.Fraction of rhIL-18-GFP with gel filtration,peak 2; 7.Purified GFP; 8.Protein MW standard

图5　rhIL-18-GFP对P815细胞的标记

　　Fig 5.FACS analysis of rhIL-18-GFP binding protein on P815

　　纯化的rhIL-18及rhIL-18-GFP经Polymyxin B Sepharose 4B去除热原质后，经鲎试验测定内毒素含量低于0.125EU/ml。

　　2.rhIL-18及rhIL-18-GFP促进PBMC的增殖： rhIL-18及rhIL-18-GFP可以协同亚适剂量的ConA促进PBMC增殖，且增殖幅度与rhIL-18及rhIL-18-GFP的浓度正相关。 但GFP加亚适剂量的ConA，或单独使用rhIL-18和rhIL-18-GFP则无促PBMC增殖作用 (图6）。

图6　rhIL-18及rhIL-18-GFP促PBMC增殖作用

　　Fig 6. Effects of rhIL-18 and rhIL-18-GFP on PBMC proliferation

　　3.rhIL-18及rhIL-18-GFP促进NK细胞的细胞毒作用： 分离的PBMC在体外加入rhIL-2及rhIL-18或rhIL-18-GFP培养24小时后, 以K562为靶细胞测定NK细胞的细胞毒作用。单加rhIL-2的PBMC对靶细胞的裂解率为25％，而同时受rhIL-2及rhIL-18或rhIL-18-GFP刺激的PBMC之靶细胞裂解率可达到40％。单独应用rhIL-18或rhIL-18-GFP刺激的PBMC，其对靶细胞裂解率与未经培养的PBMC无显著区别(6～8) %，表明rhIL-18和rhIL-18-GFP具有协同rhIL-2增强NK细胞细胞毒作用的能力 (图7）。

图7　rhIL-18及rhIL-18-GFP增强NK细胞细胞毒作用

　　Fig 7. Enhancement of human NK cell cytotoxicity in response to rhIL-18 and rhIL-18-GFP

　　4.rhIL-18及rhIL-18-GFP诱导PBMC合成IFN-γ：以PBMC为反应细胞发现, 单独加入 rhIL-18或rhIL-18-GFP刺激的细胞上清中检测不到IFN-γ, 而同时加入亚适剂量rhIL-2后, 细胞培养上清中IFN-γ含量升高，并且随 rhIL-18及rhIL-18-GFP浓度增加而提高 (图8) 。

图8　rhIL-18及rhIL-18-GFP诱导PBMC合成IFN-γ作用

　　Fig 8. Induction of IFN-γ production by PBMC in response to rhIL-18 and rhIL-18-GFP

　　讨　论

　　pET原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一，它利用噬菌体T7启动子与T7 RNA聚合酶之间作用的高度特异性及高效性使得外源基因在细菌体中表达效率提高。我们表达的rhIL-18约占菌体蛋白的40％。同时表达的rhIL-18还从表达载体质粒获得6个组氨酸，利用二价阳离子与组氨酸结合的性质，用一步螯合层析即可将表达的rhIL-18蛋白纯度提高至95％，大大提高纯化效率。由于尚未明确的原因，我们表达的rhIL-18-GFP在纯化过程中有约50％的融合蛋白自发降解释放GFP，估计断点在连接IL-18与GFP之间的G-P-G部位。天然状态下GFP以非二硫键连接方式形成同源二聚体，释放的GFP可能会有部分与rhIL-18-GFP形成rhIL-18-GFP/GFP二聚体，因此用分子筛层析也难以完全分离rhIL-18-GFP与GFP。在生物活性研究的实验中，我们以同样由大肠杆菌表达并纯化的GFP作为对照，可基本排除IL-18-GFP样品中GFP对实验结果的影响。将GFP与细胞因子融合并用于研究细胞因子受体的分布尚未见报道。初步获得的细胞标记结果表明，我们表达的rhIL-18-GFP保持了GFP的绿色荧光性质。另一方面，该融合蛋白还能与兔抗人rhIL-18抗血清反应，并具有与rhIL-18相同的一系列生物活性。因此可认为rhIL-18-GFP是一个双功能融合蛋白。rhIL-18-GFP融合蛋白还可以对某些细胞（如P815）进行特异性标记（图5），故可以用于对IL-18受体表达的调节、分布等的研究。

　　Okamura等人1993年在由痤疮丙酸杆菌 (P.acnes) 和LPS引起内毒素休克的小鼠血清中发现一种生物活性与IL-12相似的成分，具有诱导IFN-γ合成的能力，称之为IGIF ^〔7〕　　，IGIF能增强NK细胞和Fas L介导的杀伤细胞的细胞毒活性^〔8〕。在某些自身免疫病中IGIF的表达与疾病进程相关 ^〔9，10〕　　。近来，将IGIF 命名为IL-18的建议已被多数学者接受。已发现由192个氨基酸残基构成的小鼠IL-18前体需经IL-1β转化酶（ICE-1）切除N端35个氨基酸残基才能成为有活性的分子，因而推测，人IL-18前体可能也需切除N端的一段多肽后成为有活性的分子。为此我们在表达人IL-18时参考ICE-1酶切位点及小鼠IL-18分子设计了两对5引物, 分别表达从第32位天冬酰胺和第37位酪氨酸残基起始的rhIL-18分子，模拟成熟的hIL-18分子。

　　本课题受国家教委回国留学人员重点基金资助〔批准文号：教外司留(1997)436〕

　　参考文献

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　　2　Ushio S,Namba M,Okura T, et al.Cloning of the cDNA for human IFN-γ-inducing factor, expression in Escherichia coli, and studies on the biologic activities of the protein. J Immunol, 1996, 156∶4274-4279.

　　3　Gerde HH, Kaether C.Green fluorescent protein: application in cell biology. FEBS Letters,1996,389∶44-47.

　　4　Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning A Laboratory Manual.2 nd ed 1989,50-56 Cold Spring Harbor Laboratory Press.

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　　6　陈丙莺，马建吟，黄钦田等. 简易自然杀伤试验-LDH释放改良法. 上海免疫学杂志, 1989, 9∶218-219.

　　7　Okamura H, Nagata K, Komatsu T, et al. A novel costimulatory factor for gamma interferon induction found in the livers of mice causes endotoxic shock. Infect Immun,1995, 63∶3966-3972.

　　8　Dao T, Ohahi K, Kayano T, et al. Interferon-γ-inducing factor, a novel cytokine,enhance Fas ligand-mediated cytotoxicity of murine T helper 1 cells.Cell Immunol,1996,173∶230-235.

　　9　Rothe H, Hibino T, Itoh Y, et al. Systemic production of interferon-gamma inducing factor (IGIF) versus local IFN-γ expression involved in the development of Th1 insulitis in NOD mice. J Autoimmun, 1997,10∶251-256.

　　10　Rothe H, Jenkins NA, Copeland NG, et al. Active stage of autoimmune diabetes is associated with the expression of a novel cytokine, IGIF, which is location near IDD2. J Clin Invest, 1997, 99∶469-474.

(收稿：1998-06-11　　修回：1998-11-19)