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中国湖北汉族人群对同种异型抗原免疫应答与HLA遗传多态性的相关性
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第4期第19卷 HLA
作者：涂正坤 吴雄文 刘敏 姜晓丹 杨志章 吴锋 龚非力 赵修竹
单位：涂正坤 510180 广州市妇婴医院医学遗传研究所；吴雄文 刘敏 姜晓丹 杨志章 吴锋 龚非力 赵修竹 同济医科大学免疫学教研室
关键词：人类白细胞抗原；同种异型抗原；淋巴细胞；细胞；培养的
【 摘要 】 目的 研究个体之间混合淋巴细胞反应强度的差异,探讨中国汉族人群对同种异型抗原的应答水平与HLA的相关性。方法 在17个家系中进行父/子和母/子间单向混合淋巴细胞培养。结果和结论 不同组合的混合淋巴细胞反应强度,即父→子与子→父相比;母→子与子→母相比;父/子间与母/子间相比,差异均无显著性。个体对同种异型抗原的免疫应答的强度与HLA-Ⅰ类分子的型别相关,HLA-A10表型阳性个体的刺激指数SI(0.95±0.24)明显低于阴性个体(1.41±0.69),差异具有极显著性意义。
Association between the immune response to alloantigens and the genetic polymorphism of HLA in a Hubei population of the Han nationality TU Zhengkun, WU Xiongwen, LIU Min, et al. Department of Immunology, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【 Abstract 】 Objective To study the difference in the magnitude of mixed lymphocyte culture reaction (MLC) among different individuals and discuss the association between the immune response to alloantigens and the genetic polymorphism of HLA.Methods We carried out the one-way MLC between parents and children in seventeen Hubei families of the Han nationality.Results and Conclusion Our results showed that, the difference in the magnitude of MLC was not significant among various associations including father vs son/son vs father, mother vs son/son vs mother and father vs son/mother vs son. The intensity of the immune response to alloantigens were associated with the HLA class I phenotype, instead of the HLA-DRB1 alleles. The stimulation index (SI) of individuals bearing HLA-A10 antigen (0.95±0.24) was significantly lower (P＜0.01) than that of HLA-A10 negative ones (1.41 ±0.69).
【 Subject words 】 HLA Alloantigen Lymphocyte Cell,cultured
主要组织相容性复合体(MHC)最初是在研究器官移植排斥反应的过程中被发现的,MHC抗原作为代表个体特异性的主要组织抗原,在排斥反应中起关键作用。本文分析家庭成员间混合淋巴细胞反应的强度,同时进行HLA遗传多态性的家系调查,探讨中国汉族人群对同种异型抗原的应答水平与HLA的相关性,以期为拓宽同种移植供体的选择范围提供实验依据。
材料与方法
1.主要试剂：HLA-Ⅰ类分型血清板(北京中日友好医院HLA配型室);3H-TdR(中科院北京原子能研究所);丝裂霉素C(mitomycin C)、RPMI 1640(美国GIBCO公司);HLA-DRB1等位基因序列特异性引物(德国Essen大学Grosse-Wilde教授惠赠) ; Taq酶、蛋白酶K、dNTP 、琼脂糖(德国Boehringer Mannheim公司)。
2.研究对象：随机选择湖北省鄂州市汀祖镇王边村17个健康家系(包括父、母、子女各一名),采集外周静脉血标本。
3.方法
(1)外周血单个核细胞的分离。
(2)HLA-Ⅰ类抗原分型：采用国际通用的微量淋巴细胞毒试验。
(3)HLA-DRB1基因分型：采用本室参考国外文献所建立的PCR/SSP方法。
(4)混合淋巴细胞培养(MLC)： 取上述单个核细胞作为应答细胞(0.5×106/ml); 取单个核细胞悬液(0.5×106/ml)作为刺激细胞,加入丝裂霉素C(终浓度25μg/ml),37℃水浴20分钟后取出离心,细胞用RPMI 1640洗涤1次,离心去上清,重新悬浮于含20% AB型血清的RPMI 1640培养液,调整细胞浓度为0.5×106/ml备用;在同一家系的父/子或母/子间进行单向混合淋巴细胞培养,即取刺激细胞和反应细胞各0.1ml加入96孔培养板,以自身混合淋巴细胞培养作为对照(实验组与对照组每份标本均做3个复孔), 37℃ 5% CO2培养5天,加入20μl浓度为740×103Bq/ml的3H-TdR(终浓度为37×103Bq/ml),轻轻摇匀后继续培养18小时。应用β液体闪烁仪测定每分钟脉冲数(cpm),以下列公式计算刺激指数(stimulation index,SI):
上式中SIAmB代表A细胞刺激B细胞的刺激指数,即A刺激B反应的cpm值除以B被自身刺激细胞(Bm)所刺激的cpm值;SIBmA代表B细胞刺激A细胞的刺激指数,即B刺激A反应的cpm值除以A被自身刺激细胞(Am)所刺激的cpm值。
4.统计学处理：用t检验分析实验结果。
结 果
17个家系共50例标本的HLA-Ⅰ类和HLA-DRB1的分型结果见表1;17个家系内各成员间混合淋巴细胞反应的SI值及比较见表2 、3 ;HLA-Ⅰ类型别与SI的关联见表4;HLA-DRB1等位基因型别与SI的关联见表5 。结果显示,携带HLA-A10表型者其SI(0.95±0.24)明显低于阴性者(1.41±0.69),差异有极显著意义(P＜0.01);HLA-A1、-A2、-A11、-A24、-A25、-A33、-B62、-B46、-B40等表型以及HLA-DRB1等位基因与机体对同种异型组织抗原的应答水平无明显关联。本实验检出的其它HLA型别由于频率较低,无统计学意义。
表1 HLA-Ⅰ类表型和HLA-DRB1基因型的家系调查
Table 1. HLA class Ⅰ phenotype and HLA-DRB1 allel infamily analysis
| No. | HLA-A | HLA-B | HLA-DRB1 |
| 70 | A2 | B16 B27 | |
| 71 | A2 | B16 B13 | |
| 72 | A2 | B16 B13 | DRB*120X*0301 |
| 73 | A2 | B62 | DRB*070X*0901 |
| 74 | A25 | B53 | DRB*0301*150X |
| 75 | A2 A25 | B62 - | |
| 79 | - | B62 | |
| 80 | A2 | B46 | |
| 81 | A2 A24 | B16 B46 | DRB*080X |
| 82 | A2 | - | DRB*070X*0901 |
| 83 | A2 | - | DRB*040X |
| 84 | A2 | - | DRB*070X*040X |
| 85 | A11 A2 | B12 | DRB*160X*070X |
| 86 | A2 A10 | B39 | DRB*150X 1001 |
| 87 | A2 | B12 B39 | DRB*070X*1001 |
| 88 | A1 A2 | B5 B62 | DRB*070X*140X |
| 89 | A1 | B5 B40 | |
| 90 | A2 A1 | B62 | DRB*120X*070X |
| 91 | A25 | B7 B14 | DRB*070X |
| 92 | A2 | B5 | DRB*040X*0901 |
| 93 | - | B5 B14 | DRB*040X*070X |
| 94 | A10 | B35 | DRB*070X*1001 |
| 95 | A24 | B40 B46 | |
| 96 | A10 | B40 | DRB*160X*070X |
| 97 | A33 | B17 | DRB*0901*070X |
| 98 | A24 A25 | B46 | DRB*150X*1001 |
| 99 | A33 A25 | B46 B17 | DRB*150X*0901 |
| 100 | A2 | B46 B17 | DRB*0301 |
| 101 | A1 A2 | B7 B62 | DRB*120X |
| 102 | A1 A2 | B46 B62 | DRB*120X*0301 |
| 103 | - | - | DRB*070X |
| 104 | - | - | DRB*040X*110X |
| 105 | - | - | DRB*070X*110X |
| 106 | A2 | B5 B15 | DRB*150X*120X |
| 107 | A2 A11 | B5 B46 | DRB*0901*120X |
| 108 | A2 | B5 | |
| 109 | A2 A10 | B40 B62 | DRB*080X*0901 |
| 110 | A10 | B40 B17 | DRB*080X*120X |
| 111 | A2 A10 | B40 | DRB*090X*120X |
| 112 | A10 A24 | B62 | DRB*0901 |
| 113 | A9 | B40 | |
| 114 | A9 A10 | B62 B40 | |
| 115 | A2 A10 | B46 | DRB*080X |
| 116 | A2 A10 | B39 B27 | |
| 117 | A2 | B46 | DRB*080X*040X |
| 118 | A2 A33 | B62 | |
| 119 | A2 | B62 | DRB*120X |
| 120 | A2 A33 | B62 | |
| 121 | A2 | B46 | DRB*080X*0901 |
| 122 | A2 | B62 B39 | DRB*080X |
表2 17个家系中父/子和母/子间单向混合淋巴细胞反应
Table 2.The stimulation index(SI) of one-way mixed lymphocyte reaction(MLR)in seventeen families
| F→S | S→F | M→S | S→M |
| SI70m72=1.68 | SI72m70=1.20 | SI71m72=0.71 | SI72m71=1.31 |
| SI73m75=1.38 | SI75m73=0.81 | SI74m75=3.39 | SI75m74=0.39 |
| SI80m81=1.25 | SI81m80=0.54 | ||
| SI82m84=0.54 | SI84m82=1.49 | SI83m84=0.61 | SI84m83=1.86 |
| SI85m87=1.32 | SI87m85=1.00 | SI86m87=1.31 | SI87m86=1.04 |
| SI88m90=2.55 | SI90m88=2.16 | SI89m90=3.51 | SI90m89=3.37 |
| SI91m93=0.88 | SI93m91=1.02 | SI92m93=1.06 | SI93m92=1.10 |
| SI95m96=1.01 | SI96m95=0.52 | ||
| SI97m99=0.99 | SI99m97=1.43 | SI98m99=1.40 | SI99m98=1.21 |
| SI100m102=0.98 | SI102m100=0.77 | SI101m102=1.85 | SI102m101=0.99 |
| SI103m105=1.94 | SI105m103=1.01 | SI104m105=1.40 | SI105m104=0.57 |
| SI106m108=0.80 | SI108m106=1.48 | SI107m108=0.69 | SI108m107=1.45 |
| SI109m111=0.75 | SI111m109=0.79 | SI110m111=1.00 | SI111m110=0.60 |
| SI112m114=0.72 | SI114m112=1.18 | ||
| SI115m117=1.52 | SI117m115=1.43 | SI116m117=1.17 | SI117m116=0.98 |
| SI118m120=1.17 | SI120m118=1.31 | SI119m120=1.17 | SI120m119=1.72 |
| SI121m122=1.11 | SI122m121=0.55 |
Note:F=father,S=son,M=mother
表3 父/子和母/子间单向混合淋巴细胞反应的比较
Table 3.comparision of stimulation index of one-way mixed lymphocyte reaction in fathers/children and mothers/children
| SC→RC | SI |
| F→S | 1.22±0.51 |
| S→F | 1.17±0.38 |
| M→S | 1.43±0.84 |
| S→M | 1.17±0.72 |
Note:F=father,S=son,M=mother;
SC=stimulating cells,RC=responding cells,SI=stimulation index
表4 HLA-Ⅰ类抗原表型与MLC反应强度的关联
Table 4.Association between class Ⅰ HLA phenotype and stimulation index of mixed lymphocyte reaction
| HLA allele | Stimulation index | P value |
| A10(+) (n=8) | 0.95±0.24 | |
| (-) (n=44) | 1.41±0.69 | ＜0.01 |
| B62(+) (n=14) | 1.57±0.86 | |
| (-) (n=38) | 1.12±0.57 | =0.05 |
| B46(+) (n=13) | 1.11±0.41 | |
| (-) (n=39) | 1.29±0.71 | ＞0.05 |
| B40(+) (n=8) | 1.09±0.93 | |
| (-) (n=44) | 1.58±0.61 | ＞0.05 |
| B39(+) (n=4) | 1.11±0.12 | |
| (-) (n=48) | 1.26±0.67 | ＞0.05 |
| A1 (+) (n=4) | 1.49±0.60 | |
| (-) (n=48) | 1.23±0.66 | ＞0.05 |
| A2 (+) (n=32) | 1.33±0.45 | |
| (-) (n=20) | 1.05±0.34 | ＞0.05 |
| A25(+) (n=5) | 1.39±0.94 | |
| (-) (n=47) | 1.23±0.62 | ＞0.05 |
| A33(+) (n=3) | 1.24±0.16 | |
| (-) (n=49) | 1.25±0.69 | ＞0.05 |
表5 HLA-DRB1等位基因与MLC反应强度的关联
Table 5.Association between DRB1 alleles and stimulation index of mixed lymphocyte reaction
| HLA-DRB1 allel | Stimulation index | P value |
| DRB*070X(+)(n=14) | 1.38±0.76 | |
| (-)(n=23) | 1.16±0.41 | ＞0.05 |
| DRB*120X(+)(n=9) | 1.54±0.82 | |
| (-)(n=28) | 1.14±0.42 | ＞0.05 |
| DRB*040X(+)(n=7) | 1.03±0.44 | |
| (-)(n=30) | 1.32±0.61 | ＞0.05 |
| DRB*0901(+)(n=9) | 1.07±0.28 | |
| (-)(n=28) | 1.31±0.64 | ＞0.05 |
讨 论
人的MHC即HLA复合体,是位于人类第6染色体短臂上的一个紧密连锁的基因群。HLA抗原的主要功能是参与抗原提呈和免疫调节,它控制人类对各种抗原的免疫应答,也与某些疾病的遗传易感性有关。在器官移植中,HLA抗原作为一类重要的同种异型抗原,决定着供者与受者间的组织相容性,是导致移植排斥反应的关键因素。文献已报道,移植与受者HLA全相同的供体器官,其长期存活率是HLA不相符者的2倍或更高 〔1-5〕。但由于HLA分子的高度多态性,在随机人群中寻找HLA全相同的供体相当困难。临床上,仅10%的患者有可能获得HLA比较一致的移植物〔6〕。
实践中早已发现,由于对同种异体抗原的免疫应答水平存在个体差异,在某些HLA不相符的供受者间进行器官移植,也可能获得比较好的疗效〔7〕。另外,临床上在HLA全相同的同胞间进行骨髓移植的资料表明〔8〕:携带HLA-B7单体型的个体,移植物抗宿主反应(GVHR)发生率明显较低(P＜0.01);而携带HLA-B44单体型的个体,其GVHR发生率明显较高(P＜0.01)。由此提示,可根据移植后是否发生宿主抗移植物反应(HVGR)或GVHR,将供、受者间不完全相同的HLA型别的相配,分为免疫原型(immunogenic mismatch)和兼容型(permissible mismatch)两类〔9，10〕。在HLA兼容者间进行移植,其移植物存活率明显高于免疫原型个体〔9〕。在体外实验体系中,供、受者之间的兼容性主要表现为MLC中淋巴细胞的增殖程度明显较低。
本实验对 17个家系进行父/子和母/子间单向混合淋巴细胞培养。结果发现,不同组合的混合淋巴细胞反应强度,即父→子间与子→父间相比;母→子间与子→母间相比;父/子间与母/子间相比,均无显著性差异(见表3)。实验结果还发现,个体对同种抗原免疫刺激的应答水平与HLA-Ⅰ类分子的型别相关,HLA-A10表型阳性个体的SI(0.95±0.24)明显低于阴性个体(1.41±0.69),差异有极显著性意义(P＜0.01)。本实验未发现其他HLA-Ⅰ类表型或HLA-DRB1等位基因与机体对同种抗原的应答水平相关。
HLA分子是人类体内具有最复杂多态性的遗传系统。随着对HLA分子结构的深入了解,发现某些不同型别的HLA抗原,其分子结构具有极大的相似性,如HLA-B51和B52仅有两个氨基酸不同〔11〕。进一步研究还发现,同一HLA家族(如A2家族),甚至不同家族的HLA同种异型分子(如A*0301和A*1101),其抗原结合槽(cleft)所容纳的抗原肽可有相同或相似的锚定残基或肽链基序, 称为超基序(supermotif)。在HLA-Ⅰ类分子中,已鉴定出A3、B7、A2、B44这4种主要的超基序家族成员〔12〕。因此,虽然在经典理论上,供体和受体间HLA型别的任何差异均可被视为具有免疫原性,但现代观点认为,不能仅以HLA是否相同来判断供、受体之间是否为免疫原性〔9〕。临床上对同种异体移植的回顾性研究表明:某些受者可识别来自供体的、与自身不相同的HLA;而某些受者则不能识别〔9,13,14〕。
本课题借助体外MLC实验体系证实:人群对同种异体抗原的免疫应答存在着明显的个体差异,表现为携带不同HLA型别的个体对同种异体抗原的免疫应答水平各异(见图1，2)。携带HLA-A10表型的个体,其对携带一条相同单体型的供体细胞,仅产生较低的免疫应答;换言之,携带HLA-A10表型的个体,其对具有一条相同单体型的供者可能表现为“兼容性”。由此推测,某些MHC抗原多肽可能被携带特定MHC型别的受者所识别,而不能被携带其它型别的受者所识别〔9〕。这一现象,对拓宽同种异体器官移植的供体选择范围和提高移植物的存活率,具有极其重要的意义。
参考文献
1 Takemoto S,Terasaki PL,Cecka JM, et al. Survival of nationally shared HLA matched kidney transplants from cadaveric donors. N Engl Med，1992，327∶834-839.
2 Kaufman DB,Sutherland DER,Noree H, et al. Renal transplantation between living-related sibling pairs matched for zero-HLA haplotypes. Transplantation,1989,47∶113-117.
3 Opelz G. For the collaborative transplant study: In response to“the role of HLA matching renal transplant patient with sequential immunosuppression”. Clin Transplant, 1989,3∶233.
4 Opelz G,Mytilineos J,Scherer S,et al. Survival of DNA HLA-DR typed and matched cadaved transpants. Lancet,1991,338∶461-465.
5 Opelz G,Mytilineos J,Scherer S, et al. Analysic of HLA-DR matching in DNA-typed cadaver kidney transplants. Transplantation,1993,3∶233-241.
6 Breen TJ,Edwards EB,Cecka JM, et al. Outcome of cadaveric kidneys accepted as “paybacks”and transplanted during 1990-1991. Presented at the 12th Annual Scientific Meeting of the American Society of Transplant Physicians. Houston,1993，May,17-19.
7 Gjertson DW,Terasaki PL,Takemoto S, et al. National allocation of cadaveric kidneys by HLA-matching.N Engl J Med，1991，324∶1032-1038.
8 Maruya E,Takemoto S,Terasaki PL. HLA matching: Identification of permissible HLA mismatches. Clin transplant，1993，511-520.
9 Hansen JA,Anasetti C,Martin PJ, et al. Allogeneic marrow transplantation:the seattle experience. Clin transplant，1993，193-209.
10 Parham P,Lawlor DA,Lomen CE, et al. Diversity and diversification of HLA-A,B,C alleles.J Immunol，1989，142∶1937-1942.
11 周光炎, 范丽安.HLA新的进展和新的起点——记第12届国际组织相容性会议.上海免疫学杂志，1996，16∶321-324.
12 Clark BD,Leong SW. Crossmatch predicition of highly sensitized patients in: Tersaki PL, Cecka JM, Eds. Clin transplants 1992. Log Angeles UCLA TissueTyping Laboratory，1993，435-447.
13 Thompson JS,Bryne JE,Hempel JW, et al. Computer algorithm predicts both acceptable and unacceptable private and public HLA class I antigens in highly sensitized patients. Transplant Proc，1993，25∶251-257.
14 Smyth LA,Casper JT,Chitambar CR, et al. The MHC influences acute graft versus host disease in MHC matched adults undergoing allogeneic bone marrow transplantation.Bone-Marrow-Transplant，1993， 12∶351-356.
(收稿：1998-03-30 修回：1998-09-21)