用ARMS/PCR-SSP方法对湖南籍汉族人HLA-A 座位多态性分析

用ARMS/PCR-SSP方法对湖南籍汉族人HLA-A 座位多态性分析

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第4期第19卷 HLA

作者：邹义洲　郭实士

单位：410078 长沙，湖南医科大学免疫学研究室〔邹义洲(研究生) 现工作单位：410005 湖南省卫生防疫站 郭实士(导师)〕

关键词：HLA-A座位多态性；ARMS/PCR-SSP；HLA基因分型

　　【 摘要 】　目的　研究湖南汉族人群HLA-A 座位等位基因的分布情况，了解HLA的民族遗传背景，为HLA其它研究提供基础资料。方法　收集连续三代以上湖南籍汉族健康人血样，采用12th WS提供的ARMS/PCR-SSP方法作HLA-A 座位的DNA分型。从基因组DNA直接扩增，电泳后(溴乙锭染色液加入琼脂糖中)紫外光下按12th WS提供的标准判读结果，指定等位基因特异性。结果　66例湖南汉族人群HLA-A座位的等位基因频率以A*11G1(27.10%)、A*02(21.60%)、A*33(12.40%)和A*24G1(10.40%)为高，与本室用11th WS血清学方法分型的基因频率基本一致。但本方法是从DNA直接检测等位基因，可检出个别碱基的突变型，结果可分出不同亚型，因而对疾病发病机制等研究远优于血清学分型(蛋白质水平)。A*02的分型结果以A*02G3(9.30%)、A*02G1(8.20%)和A*0203(4.10%)三个等位基因频率最高。结论　ARMS/PCR-SSP作高分辨的HLA-A、B、C座位等位基因分型是国际协作研究(12th WS )的第一次正式实施。本实验结果可作为湖南汉族人HLA-A座位等位基因频率的群体资料和正常参考值，为进一步开展HLA研究提供实验数据。

　　Study of polymorphism HLA-A locus allele using ARMS/ PCR-SSP on Hunan Hans　ZOU Yizhou, GOU Shishi. Research Laboratory of Immunology, Hunan Medical University, Changsha 410078

　　【 Abstract 】　Objective　To explore the inhereditary background of HLA in the Han Nationality of Hunan Province for other associated studies, we observed the distribution of HLA-A locus alleles in population of Hunan Hans.Methods　The polymorphism of HLA-A locus allele was determined with ARMS/PCR-SSP method for DNA typing. Direct amplification from genomic DNA and after electrophoresis the result reading was carried out with the method provided by 12th WS（International Histocompatibility Workshop and Conference）.Results　Our DNA typing data, HLA-A locus allele polymorphism of 66 normal Hunan Hans cases was submitted to and corrected by the central database of 12th WS. The results showed that the allele frequencies of A*11G1(27.10%), A*02(21.60%), A*33(12.40%), and A*24G1 (10.40%) were higher than those of other alleles. G (group) suffix means a set of alleles which cannot be split using the current typing system. Of seven A*02 subtypes, A*02 G3(9.30%), A*02G1(8.20%) and A*0203(4.10%) were found in Hunan Hans.Conclusions　 HLA class I DNA typing was used officially for the first time in 12th WS. The ARMS/PCR-SSP DNA typing can identify directly the subtypes of alleles from genomic DNA and find the single base difference between alleles. When the frequency of each allele in Hunan Hans was compared with the combined world frequency of that allele on 2471 individuals in 45 populations, it could be found that the allele frequencies of A*02G3, A*11G1 (P＜0.001) and A*33(P＜0.01) in Hunan Hans were higher significantly than that in combined world, but the allele frequencies of A1 and A3 were lower significantly and that of A11, A24 and A33 higher remarkably in Hunan Hans than that in Swedish. All of these results indicate that there is a distinct inhereditary background among the Han Nationality of Hunan Province, so this result will be the basic and reference data in Hunan Hans.

　　【 Subject words 】　Polymorphism of HLA-A　　ARMS/PCR-SSP　　Gene typing

　　1991年第十一届国际HLA协作科研(11th WS)已正式明确HLA-Ⅱ类的DNA分型方法。本室于1993年报道了用PCR/SSO方法对湖南籍汉族人HLA-DR、DQ和DP座位多态性分析结果^〔1〕。迄今，HLA-A、B和C的分型主要沿用血清学分型方法，即采用微量淋巴细胞毒试验。此法需要活的淋巴细胞和一整套特异性抗血清或单克隆抗体(具有种族差异)，故在推广应用中受到限制。1993年Browning等发展了一种直接从基因组DNA特异扩增HLA-A座位的方法。该法应用联合序列特异性引物(combination of sequence-specific oligonucleotide primers)进行扩增，为引导PCR特异性扩增，在引物3＇末端错配1个碱基，即ARMS/PCR系统(amplification refractory mutation system)^〔2〕。Krausa等应用ARMS/PCR-SSP方法对HLA-A座位等位基因亚型进行高分辨的DNA分型^〔3〕。12th WS第一次正式采用该法作HLA-A 、B和C座位等位基因分型。我们应用12th WS提供的HLA-A座位DNA分型引物及方法(ARMS/PCR-SSP)， 对湖南籍汉族人HLA- A座位多态性进行DNA分型， 并由12th WS中心数据库(central database)对本结果进行复核再返回。现将研究结果报道如下。

　　材料和方法

　　1.对象:66名志愿献血者系本校健康学生。均为连续第三代以上的湖南籍汉族人。

　　2.引物: (1)扩增引物:ARMS/PCR-SSP联合引物由12th WS 提供，序列特异性引物的核苷酸序列，寡核苷酸长度及熔解温度(Tm)列于表1；40种特异性引物(21种编码引物，19种非编码引物)组合成32种联合引物，列于表2。编码引物(coding primer) 是编码HLA-A分子的α1区(domain)的第2外显子。非编码引物(noncoding primer) 是编码α2区的第3外显子的寡核苷酸。这两个外显子包括了HLA-A座位的绝大部分多态性，其扩增产物为包括外显子2与外显子3之间的内含子(240bp)在内的核苷酸片段。 (2)实验内对照引物:本次设计的一对阳性内对照引物(PIC#1和PIC#A) 扩增腺样瘤结肠息肉(adenamoutous polyposis coli)基因(位于第5号染色体的DP2.5)的第15外显子引物。扩增产物为256bp片段(表1)，用作PCR的质量控制。

表1　HLA-A PCR-SSP引物核苷酸序列

　　Table 1. Nucleotide sequences of the PCR primers used for HLA-A gene typing. (The length and melting temperature(Tm) are given)

Primers	nucleotide sequence(5＇-3＇)	LH	Tm (℃)
Coding primers
AL#4	GGA GTA TTG GGA CCG GAA C	19	60
AL#6	ACG GAA TGT GAA GGC CCA G	19	60
AL#7	AGC GAC GCC GCG AGC CA	17	60
AL#8	GGC CGG AGT ATT GGG ACG A	19	62
AL#10	GAT AGA GCA GGA GAG GCC T	19	60
AL#11	TCA CAG ACT GAC CGA GAG AG	20	62
AL#12	CCC GGC CCG GCA GTG GA	17	62
AL#13	GTG GAT AGA GCA GGA GGG T	19	60
AL#16	GGA CCA GGA GAC ACG GAA TA	20	62
AL#17	CCG GAG TAT TGG GAC CTG C	19	62
AL#22	CCA CTC CAT GAG GTA TTT CTT	21	60
AL#24	CAC GCA GTT CGT GCG GTT T	19	60
AL#25	TGA GGT ATT TCT ACA CCT CCA	21	60
AL#28	GCG ACG CCG CGA GCC C	16	60
AL#30	CGG AAT GTG AAG GCC CAC T	19	60
AL#31	CGG AAT GTG AAG GCC CAG T	19	60
AL#32	CCG AGT GGA CCT GGG GAC	18	62
AL#34	ACT CAC AGA CTG ACC GAG C	19	60
AL#35	AGG ATG GAG CCG CGG GCA	18	62
AL#37	TCC TCG TCC CCA GGC TCT	18	62
AL#54	GAA GGC CCA CTC ACA GAC TA	20	62
Non-coding primers
AL#C	ATG TAA TCC TTG CCG TCG TAA	21	60
AL#D	CAC TCC ACG CAC GTG CCT	18	60
AL#F	AGC GCA GGT CCT CGT TCA A	19	60
AL#G	CCG TCG TAG GCG TGC TGT	18	60
AL#H	CCA AGA GCG CAG GTC CTC T	19	62
AL#I	CTC TCT GCT GCT CCG CCG	18	60
AL#L	CAA GAG CGC AGG TCC TCG	18	60
AL#Q	CCT CCA GGT AGG CTC TCA A	19	60
AL#R	CCT CCA GGT AGG CTC TCT G	19	62
AL#V	GAG CCA CTC CAC GCA CGT	18	60
AL#Y	CCG CGG AGG AAG CGC CA	17	60
AL#Z	AGG TAT CTG CGG AGC CCG	18	60
AL#AE	CTC CGC CTC ATG GGC CGT	18	62
AL#AK	TAC TGG TGG TAC CCG CGC	18	62
AL#AM	CGT CGT AGG CGT CCT GCC	18	62
AL#AR	CTG GTA CCC GCG GAG GAG	18	62
AL#AW	GTG GCC CCT GGT ACC CGT	18	62
AL#BJ	CCG ACC CCA CGT CGC AGG CAC	21	74
AL#BK	GAG CCC GTC CAC GCA CTC	18	62
Positive internal control priners
PIC#1	ATG ATG TTG ACC TTT CCA GGG	21		62
PIC#AN	ATT CTG TAA CTT TTC ATC AGT TGC	24		60

　　表2　HLA-A座位PCR-SSP引物组合及扩增的特异性产物

　　Table 2. PCR-SSP combinations for the HLA-A gene DNA typing panel with their specificity and product size

mix 　　No.	coding 　　primer	noncoding 　　primer	specificity	size 　　(bp)
01A	AL#16	AL#Z	A*01	574
02A	AL#16	AL#V	A*3601	563
03A	AL#37	AL#AW	A*02	813
04A	AL#7	AL#D	A*03	626
05A	AL#8	AL#Q	A*23	555
06A	AL#8	AL#R	A*24	555
07A	AL#11	AL#C	A*25	398
08A	AL#34	AL#C	A*26/4301	400
09A	AL#4	AL#C	A*25/26/3/66 not 4301	438
10A	AL#6	AL#C	A*34/66	417
11A	AL#17	AL#C	A*4301	440
12A	AL#6	AL#I	A*11	518
13A	AL#6	AL#H	A*68/6901	445
14A	AL#4	AL#AM	A*6801/3402	426
15A	AL#25	AL#H	A*6802	623
16A	AL#6	AL#Y	A*6901	405
17A	AL#35	AL#F	A*29	515
18A	AL#12	AL#G	A*30	560
19A	AL#10	AL#F	A*31	481
20A	AL#11	AL#F	A*3201	421
21A	AL#4	AL#F	A*33	461
22A	AL#24	AL#AR	A*3201/7401	494
23A	AL#32	AL#F	A*29/31/33/7401not30/3201	414
24A	AL#54	AL#BK	A*8001	543
25A	AL#30	AL#H	A*02/23/24/68/69	446
	AL#31
26A	AL#30	AL#L	Not A*02/23/68/69	446
	AL#31
27A	AL#22	AL#AK	A*0202	580
28A	AL#13	AL#AE	A*0203	553
29A	AL#13	AL#R	A*0212/13	574
30A	AL#13	AL#BJ	A*0207	404
31A	AL#28	AL#AK	A*02020/05/08/4	479
32A	AL#13	AL#Q	A*0201/04/06/07/ 　　09/10/11/14	574

　　3.主要试剂:蛋白酶K为Serva产品、FD-DNA多聚酶及PCR缓冲液购自上海复华公司、dNTP为Promega产品；电泳指示剂甲酚红(Dynal产品)直接掺入PCR 扩增反应体系中。

　　4.操作步骤:按12th WS HLA-I类ARMS/PCR-SSP分型手册进行，主要过程简述如下。

　　(1)基因DNA提取: 取0.5ml血液，用EDTA抗凝，加1ml细胞裂解缓冲液(12mmol/L Tris-HCl pH 7.5)混合，13　000r/min 离心去除红细胞，收集白细胞沉淀，加100μl 5mol/L NaCl ，摇匀后加入240μl 蒸馏水稀释，用300μl苯酚-氯仿混合液(pH 7.5)抽提DNA ，加异丙醇沉淀DNA，轻轻混匀至絮状DNA析出。 用70%乙醇洗涤DNA3次，加100μl TE 溶液(10mmol/L Tris-HCl,0.1mmol/L EDTA,pH8.0)，测吸光度A值，调节DNA浓度至200μg/ml，-20℃保存备用。

　　(2)PCR反应:PCR反应条件参照12th WS提供的方法，结合本室的具体条件适当修改。PCR反应的总体积为13μl, 包含100ng基因组DNA，2.6μl 5×PCR缓冲液,1.3μl 2mmol/L dNTP, 5% 甘油,100μg/ml 甲酚红,特异性引物0.2μmol/L,内对照引物0.5μmol/L,加FD-DNA 多聚酶0.4U。PCR扩增采用二套温度循环法:96℃ 预变性120秒后进入第一套温度循环:96℃ 15秒，70℃ 60秒，72℃ 30秒，5次循环后进入第二套温度循环:96℃ 15秒，65℃ 60秒，72℃ 40秒，25个循环。最后72℃维持10分钟。取10μl PCR产物直接加入含有0.5μg/ml溴乙锭的2%琼脂糖泳槽，100V 电泳30分钟，于紫外透射灯下观察。

　　(3)结果分析: 利用12th WS中心数据库提供的一套“Kapture”软件，由微机解释HLA-A分型结果。

　　结　果

　　1. 湖南籍汉族人HLA-A等位基因频率分布：用ARMS/PCR-SSP方法作HLA-A等位基因分型，结果列于表3(经12th WS中心数据库审核后的结果)。由表3可见，66例湖南籍汉族人共检出HLA-A座位中的15种等位基因，其中以A*11G1(27.10%)、A*02(21.60%)、A*33(12.40%)和A*24G1(10.40%)的基因频率最高。

表3　66名湖南籍汉族人HLA-A座位的等位基因频率

　　Table 3. The frequency of HLA-A alleles in Hunan Hans

Allele	Positive(%)	Frequency(%) 　　n=66	Allele	Positive(%)	Frequency(%) 　　n=66
A*01	1.40	0.70	A*2607	0.00	0.00
A*02G1	15.70	8.20	A*29	0.00	0.00
A*0202	0.00	0.00	A*30	8.20	4.20
A*0203	8.00	4.10	A*3101	0.00	0.00
A*02G2	0.00	0.00	A*3201	0.00	0.00
A*02G3	17.70	9.30	A*33	23.60	12.60
A*02G4	0.00	0.00	A*34G1	0.00	0.00
A*0214	0.00	0.00	A*3402	0.00	0.00
A*03	3.60	1.80	A*3601	1.40	0.70
A*11G1	46.90	27.10	A*4301	0.00	0.00
A*1103	0.00	0.00	A*6801	0.00	0.00
A*2301	0.00	0.00	A*6802	6.10	3.10
A*24G1	19.70	10.40	A*6803	0.00	0.00
A*24G2	7.50	3.80	A*6901	2.98	1.50
A*2501	0.00	0.00	A*74G1	8.40	4.30
A*26G1	0.00	0.00	A*7403	0.00	0.00
A*26G2	0.00	0.00	A*8001	1.59	0.80

“G”=group，a set of alleles which cannot be split using the current typing system

　　每次PCR产物电泳后，在紫外光下观察，可见一条256bp阳性内对照带(可排除假阴性反应)，阳性特异性带可由引物编组号(泳道)内产物的大小或位置判定，并由不同的反应格局判定序列特异性引物扩增的相应等位基因。图1为PCR产物电泳后紫外光下的照片，可观察到杂合子基因型。

图1　用ARMS/PCR-SSP对一个样本HLA-A位点的DNA分型琼脂糖电泳紫外灯下照片

　　Fig 1. Illustration of typical HLA-A ARMS/PCR-SSP genotype of one individual

　　Included in each PCR reaction was a positive internal control primer pair which gave rise to a 256bp fragement,and the special positive lanes in 03,12,25,26,30,32,M=Φ 174 DNA/Hae Ⅲ marker

　　本次观察样本HLA-A座位基因型频率分布，经Hardy-Weinberg测验^〔4〕，其观察值与期望值吻合(χ²=93.5840，υ=78，P＞0.10)。

　　2. A*02亚型分析：对28名检出A*02基因的个体进行亚型分析，检出A*02G1(8.20%)、A*0203(4.10%)和A*02G3(9.30%)三种亚型。2例分别为A*02G1、 A*0203和A*02G1、 A*02G3的杂合基因型；21例为与其它等位基因杂合的基因型；5例只检出一个等位基因，即A*02中的一个亚型。

　　讨　论

　　HLA-I类分子的特异性决定于α1与α2区，为两个特异性核苷酸序列， 即两个外显子编码的肽段，因而对HLA-Ⅰ类的DNA分型造成困难。Bodmer实验室设计用联合引物对从基因组DNA直接作PCR-SSP。两对引物同时扩增、延伸，致使两个外显子与其间的内含子连接成一个大的特异性基因片段，即可获得HLA-Ⅰ类特异性等位基因产物。为使PCR扩增具有等位基因特异性，在引物3＇端有意错配一个碱基， 阻止了非特异性扩增(即ARMS/PCR)。同时用一个扩增较小相对分子质量的引物作内对照以防止假阴性，从而可用基因组DNA直接检测HLA-A、B和C座位的等位基因^{〔3，5，6〕}。

　　人基因组DNA中HLA-Ⅰ类基因区富含GC碱基，需要较高的变性温度才能展开靶DNA互补链。但过高的变性温度可能降低多聚酶的活性和PCR扩增效率；有学者在反应体系中加入适量的DMSO，以提高扩增效率； 也有学者采用预变性后加多聚酶的方法。但对于一个标本同时要进行32次PCR的基因分型方法，其操作过于繁琐。本次试验采用较高的变性温度(96℃)，缩短变性持续时间，仍获得很高的扩增效率。同时为简化实验步骤，直接将观察琼脂糖电泳的指示染料(甲酚红)加入到PCR反应体系中，对PCR反应无明显影响。PCR-SSP每次反应都存在两类引物，除特异性引物外，还有一对内对照引物。采用两套温度循环法使特异性引物优先扩增，提高特异性引物反应的模板数量。进入第二套温度循环后保证特异性引物扩增不受内对照引物竟争性抑制的影响，同时大大地减少了非特异性反应。本方法从取样、DNA 提取、PCR 反应到琼脂糖电泳分析结果耗时3小时， 特别适用于临床紧急情况下的器官或组织移植配型。ARMS/PCR-SSP 方法应用于HLA-A等位基因分型， 应严格按标准化程序操作，PCR反应各项参数的很小改变都可能影响实验结果； 还可能出现非特异性扩增产物，给HLA-A的分型结果判断带来困难，有待进一步改进。

　　本次用ARMS/PCR-SSP方法检出的湖南籍汉族人HLA-A座位的基因频率，与本室在11th WS用血清学分型的基因频率^〔7〕(由抗原频率推算)比较(表4)，两者基本一致。均以A2、A11、A24基因频率高，而A23、A25、A26、A29、A32、A34和A43为零。 本结果与日本人的HLA-A分型结果基本一致，但A1、A3基因频率明显低于瑞典白人，而A11、A24、A33则显著高于瑞典白人^〔8〕。12th WS人类学组总结了世界不同实验室45个群体2471份样本HLA-A座位等位基因DNA分型结果。可见湖南汉族人的A*02G3与A*11G1(P＜0.001), A*33(P＜0.01)和A*24G2(P＜0.05)均显著高于其他群体，提示湖南籍汉族人的遗传背景与白种人及其他某些种族不同。

表4　不同群体A座位等位基因频率比较

　　Table 4. Comparison of HLA-A allele frequencies in different population

Allele	Hans(Hunan)		Japanese 　　(ser)	Swedish 　　(PCR)
	(PCR)	(ser)
A1	0.70	0.00	0.50	14.80
A2	21.60	34.87	24.60	34.90
A3	1.80	2.30	0.60	13.60
A11	27.10	31.01	9.00	5.40
A24	14.20	19.28	35.60	9.00
A33	12.60	6.26	6.80	0.90

Ser=serologic typing

　　本文提供湖南籍汉族人HLA-A座位等位基因频率的群体资料，对进一步开展HLA遗传学特征、HLA与疾病关联、细胞与器官移植、法医学检查等均具有重要意义。

　　本课题受国家自然科学基金(项目号：3927066)与CMB资助

　　参考文献

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(收稿：1998-04-20　　修回：1998-08-17)