铜绿假单胞菌的GM-PFGE分型的研究

铜绿假单胞菌的GM-PFGE分型的研究

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第4期第19卷 细菌学

作者：韩黎　吴桂芝　陈世平　霍云燕

单位：韩黎 陈世平 霍云燕　100853 北京，解放军总医院；吴桂芝　解放军第309医院

关键词：铜绿假单胞菌；基因脉冲电泳；相似性系数

　　【 摘要 】　目的　研究全基因组DNA稀有位点限制性内切酶酶切脉冲电场电泳图谱(GM-PFGE)在铜绿假单胞菌基因分型中的应用,并与表型分型比较。方法　对1个月内来自两个医院的病人及环境的20株铜绿假单胞菌进行了GM-PFGE图谱分析，同时进行30种生化反应的统计分型、23种药物的敏感性分型、胞外脂多糖的血清抗原分型；并利用数值分类软件包进行相关性比较研究。结果　临床致病铜绿假单胞菌的生化表型基本稳定,但其药物抗性的获得与丢失较为明显。血清型、生化性状及药物抗性之间无明显对应关系。当2菌株GM-PFGE图谱条带相似系数大于80%时，为同一菌株的不同克隆亚型，当相似系数在25%～70%之间时，则为不同菌株。结论　GM-PFGE分析可显示染色体结构的区域多型性,其重复性好，分辨率明显高于表型分型，结果可靠，必将成为铜绿假单胞菌或其它病原微生物分子流行病学研究的有力工具。

　　Pseudomonas aeruginosa genotyping using genome macrorestriction analysis with pulsed field gel electrophoresis　HAN Li^*, WU Guizhi, CHEN Shiping, et al. ^*　Department of Hospital Infection, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853

　　【 Abstract 】　Objective　To apply genome macrorestriction-pulsed field gel electrophoresis (GM-PFGE) for genotyping the Pseudomonas aeruginosa isolates, and with which patterns of phenotypes of the individual isolates are compared.Methods　Twenty P.aeruginosa strains collected from patients in two hospitals and the environment of one hospital within 1 month period were analysed with GM-PFGE. The individual genotypes were compared with patterns of resistance to 23 antimicrobial agents, patterns of 30 biochemical properties and lipopolysaccharide (LPS) serotypes in MINTS software.Results　The biochemical properties of 20 P.aeruginosa strains were little different, whereas, the acquisition or loss of resistance to antimicrobial agents was distinct and there were no corresponding relations between biochemical properties, resistance to antimicrobial agents and serotypes. Quantitative comparison of similarities of macro-restriction fingerprinting patterns disclosed two discrete ranges. Those that the similarity of patterns was equal to or over 80% could be subclones of the same strain, and those with 20%-70% similarities could be different strains.Conclusions　By indexing regional polymorphisms throughout the chromosome structure, GM-PFGE can monitor subclonal evolution of P. aeruginosa and identify isogenic resistance mutants. With its higher discrimination power than phenotyping and its good reproducibility, it has been a reliable tool of molecular epidemiology and nosocomial research for P.aeruginosa and other pathogens.

　　【 Subject words 】　Pseudomonas aeruginosa　　Genome macrorestriction-pulsed field gel electrophoresis　　Coefficient of similarity

　　致病微生物的分型方法很多，有表型分型方法，如血清学分型、噬菌体分型等；基因分型方法，如质粒分析、基于pilin基因、rDNA的探针杂交技术、RFLP、PCR(RAPD)^〔1〕等。但基因分型方法虽较先进但仍有其不足之处。如质粒图谱分型有一定局限性，仅有约20%的铜绿假单胞菌携带质粒^〔2〕；DNA探针杂交图谱分型仅能识别探针敏感区内或附近的酶切位点的变化,所以分辩力取决于靶序列的突变频率, 较为有限。随机引物PCR扩增多态性(RAPD)，由于临床菌株的DNA模板影响因素太多，结果不稳定, 重复性差。GM-PFGE分析，是选择切割位点较为稀少的限制性内切酶对全基因组DNA进行酶切, 借助脉冲电场凝胶电泳(PFGE)技术^〔3〕，在稳定的条件下, 对得到的DNA大片段进行分离, 显示染色体结构的区域多型性，清晰分辨其同源性，对铜绿假单胞菌的分型有适用性。

　　材料与方法

　　1.实验菌株(铜绿假单胞菌)：标准株1株(ATCC 27853); 临床分离株16株(解放军总医院微生物科与解放军第304医院检验科各8株); 环境株3株(取自解放军总医院临床科室病房的物体表面及空气)。

　　2.生化分型与药敏实验： 挑取一定量菌,用0.45%的无菌生理盐水稀释, 浓度达1.0 McFarland (用麦氏比浊管或电子比浊仪测量)。利用VITEK-AMS, 自动微生物分析仪的GNI卡，完成各实验菌株的30种生化反应测定。抗生素包括头孢氨噻肟、头孢噻甲羧肟、头孢甲氧噻吩、噻肟单酰胺菌素、庆大霉素、丁胺卡那、妥布霉素、呋喃坦啶、氨苄青霉素、西力欣、氧哌嗪青霉素、头孢呋肟、头孢哌酮、氟哌酸, 环丙氟哌酸、复方新诺明、亚胺硫霉素、羧噻吩青霉素, 羧噻吩青霉素/棒酸、硫苯咪唑青霉素、头孢唑啉、头孢噻吩，用VITEK-AMS系统的Gram negative suspectibility卡进行试验。

　　3.血清分型： 标准操作见卫生部成都生物制品研究所生产的铜绿假单胞菌诊断血清试剂盒。

　　4.GM-PFGE：基本步骤见文献〔4〕，本实验略有改进。将铜绿假单胞菌接种于LB培养基中, 37℃ 200r/min旋转培养18小时, 使细胞数达10⁹/ml。取100μl培养液离心收集细胞并洗涤悬浮于100μl L缓冲液( 0.1 mol/L EDTA pH 8.0,0.01mol/L Tris-Cl pH 7.6, 1mol/L NaCl)中，与等体积低熔点胶（‘InCert’ agarose, FMC Co, Rockland, ME, USA)混匀，于4℃制成胶块。包埋细胞的胶块于1mg溶菌酶/1ml L缓冲液中, 37℃酶解2小时。然后经STE洗涤,用1mg/ml蛋白酶K 酶解约16～20小时。接着在2mmol/L PMSF中孵育2次, 每次约45分钟。再经STE充分洗涤3次, 室温下, 将胶块与含50U SpeⅠ限制性内切酶的缓冲液混合,于37℃孵育18～19小时后,洗涤,上样电泳。

　　脉冲场电泳装置为Bio-Rad公司的Gene-Path系统。采用0.9%的琼脂糖凝胶, 0.5×TBE缓冲液,电泳温度为14℃, 电泳参数选择自动程序。电泳结束后，以EB染色15分钟, 去离子水脱色45分钟, 然后在302nm紫外灯下观察并拍照。

　　5.统计学处理：所有PFGE基因组指纹图谱及生化、药敏实验结果均进行数值分类。用中科院微生物所数值分类软件包以平均链锁聚类分析进行处理。

　　结果与讨论

　　1.表型分型：目前临床致病的铜绿假单胞菌的生化表型基本稳定, 主要变化在于不同菌株对MAN(甘露醇) 及XYL(木糖)的利用等性状的不同。以95%的相似系数为标准( 相当于2种生化反应的不同)，该20株相关性不大的铜绿假单胞菌仅可分为二型，不能体现菌株间的多型性(图1)。但各种酶及代谢产物与菌株的侵袭力、致病性等密切相关, 是基因变异的直接体现。其中301P8与301P6菌株虽为同一病人不同分离株，基因组型也几乎完全一致，但氧化酶性状却截然相反。

图1　生化表型相似性关系图谱

　　Fig 1. Tree of similarity of biochemical properties among 20 P.aeruginosa

　　由于耐药性变化的多样性与不稳定性, 目前尚无较完善的耐药性图谱的分型标准。对23种抗生素的敏感图谱进行平均链锁聚类方式统计分析, 以相似系数80%为界限，可分为6型, 而以95%为界限(相当于对2种药物的抗性不同), 则分为16型。所测23种药物均有自己的耐药性菌株(图2)。

图2　耐药性表型相似性关系树状谱

　　Fig 2. Tree of similarity of resistance to antibiotics of 20 P.areuginosa

　　2.GM-PFGE基因组分型电泳图谱(图3)：GM-PFGE图谱中条带的多少主要取决于基因组的(G+C)%及限制性内切酶酶切位点的多少^〔5〕。铜绿假单胞菌的基因组(G+C)%为67.2%，其GM-PFGE分型常用的限制性内切酶有SpeⅠ,DraⅠ, xbaⅠ等。它们的酶切片段均少于50条，且多集中于电泳凝胶的前部。XbaⅠ的切割位点最多, speⅠ最少。实验中铜绿假单胞菌基因组经SpeⅠ酶切后, 得到了约15～20条片段,大小多集中于350～1　125kb之间。GM-PFGE获得的只是染色体基因组DNA的指纹图谱，更为稳定、可靠。快速制备全基因组的程序也有报道^〔6〕。

图3　301医院铜绿假单胞菌病人分离株GM-PFGE图谱

　　Fig 3. Major macrorestriction genomic types determined with SpeⅠ analysis among P.aeruginosa isolates from the patients in 301 hospital

　　另外, 我们摸索出一条周期短（3天）, 但效果较为理想的铜绿假单胞菌全基因组DNA制备程序，为今后GM-PFGE分型工作的临床普及应用打下了良好基础。目前国外已有针对某些特定种, 如金黄色葡萄球菌^〔6〕、表皮葡萄球菌和肠球菌PFGE 的全基因组DNA快速制备程序^〔7〕。

　　3.GM-PFGE相似性关系图谱(图4)及分型标准的建立：本实验在国内首次建立了铜绿假单胞菌的GM-PFGE图谱的较为适宜的分型界域，即：差异条带为4～5条, 相似系数为70%～80%, 是铜绿假单胞菌菌株GM-PFGE图谱分型的界域。当两样品电泳图谱条带相似系数大于80%时，为同一菌株的不同克隆亚型; 当相似系数在25%～70%之间时，则为不同菌株。国外有研究表明，同一病人的分离株中, 差异条带少于5条, 相似系数在80%以上的菌株约占90%，而差异条带数为14～45, 相似系数小于70%的仅占10%左右; 不同病人分离株中, 结果恰恰相反, 前者仅占1%, 后者却占99%^〔8〕。尚需特别指出的是，在某些特殊的环境和调查时间内, 某些特定基因组分型方法的图谱分型相似系数界值最好由统计分析得出。

图4　20株铜绿假单胞菌GM-PFGE图谱相似性关系图谱

　　Fig 4.Tree of similarity of genome macrorestriction fingerprinting of 20 P.aeruginosa

　　4.各类分型方法之比较 (表1)： 实验中所选用的铜绿假单胞菌以痰、伤口创面标本居多, 也有血液标本。它们的血清O型抗原有10种，以P6、P1居多。其中, 304P4, 304P6, 301E1菌株呈现双抗原性,301E7则无法确定血清型。血清学分型虽简便，但对目前日益增多的LPS变异株仍难以分型。菌株对抗生素的耐药性图谱共16型,但结果不稳定，重复性差，证明了抗性变化与菌株基因组突变及环境的选择密切相关。生化分型的效果则较弱，仅有2型。由于耐药质粒在细菌间的转移，相同耐药谱的菌株可有不同的血清型，相同血清型的菌株的耐药谱可能不同。

表1　不同分型方法的分型结果比较

　　Table 1.Comparison of P.aeruginosa strains typing results with different methods

Strains form	Strain＇s No.	Source	Serotype code	Biochemical 　　profile	Antimicrobial 　　profile	GM-PFGE 　　profile
Standard	ATCC27853	ATCC	P6	Ⅰ	a	A
Patients	301P1	SP.	P6	Ⅰ	b	B
	301P2	SP.	P11	Ⅰ	c	C
	301P3	SP.	P3	Ⅱ	d	D
	301P4	B.	P3	Ⅰ	e	E
	301P5	W.	P6	Ⅰ	f	F
	301P6	SP.	P1	Ⅰ	g	G
	301P7	SP.	P1	Ⅰ	h	H
	301P8	SP.	P1	Ⅰ	i	G
	304P1	SP.	P8	Ⅰ	i	I
	304P2	W.	P18	Ⅰ	j	J
	304P3	W.	P20	Ⅰ	c	K
	304P4	W.	P6,P1	Ⅰ	c	L
	304P5	W.	P7	Ⅰ	k	M
	304P6	SP.	P16,P20	Ⅰ	l	N
	304P7	W.	P3	Ⅰ	m	O
	304P8	SP.	P20	Ⅰ	n	P
Environ	301E1		P10,P19	Ⅰ	o	Q
	301E2		P11	Ⅰ	c	R
	301E7		-	Ⅰ	p	S

*Ninety five percent similarity coefficient is the landmark both for typing in biochemistry and in drug-sensitivity spectrum

　　**The method for typing in drug-sensitivity spectrum is unstable and no strict typing standard is existing

　　实验中GM-PFGE将实验菌株分为19个型。不同病人菌株及环境株均有较为独特的电泳图谱，条带清晰，结果稳定。两院不同病人分离株及环境株的GM-PFGE图谱的相似系数均低于70%, 而同一病人分离株，如301P6与301P8的图谱相似系数达86.44%, 可划为同一菌株的不同亚型。

　　5.药物抗性与GM-PFGE图谱：在铜绿假单胞菌的抗生素抗性获得、丢失与基因相似性关系的研究中，只有对2种或2种以上药物的敏感性发生变化（这在药物敏感性试验的重复性误差范围之外）时, 才能将克隆抗性变化前后的基因图谱进行比较。国外有研究表明19%发生抗生素耐药性变化的克隆基因图谱有较大差异, 即属于不同菌株的置换; 而56%的抗生素耐药性变化与菌株亚型间染色体的结构变化有关, 即基因图谱间仅有较小差异。然而25%的抗生素耐药性的漂移往往不伴随着基因组图谱变化, 这可能与耐药性决定簇表达的变化有关; 或这些抗性变异株可能在限制性内切酶的酶切位点不展现多型性, 毕竟这些位点只占染色体的0.01%。本研究中85%的GM-PFGE图谱变化与耐药性图谱变化相关^〔8〕，因此我们推论：病原体基因组内的突变频率可能远高于经典理论值10^－4～10^－5(细菌自身基因的突变频率), 并与临床分离病原体耐药菌株的激增密切相关。

　　参考文献

　　1　Mahenthiralingan E, Campbell ME, Foster J, et al. Random amplified polymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from patients with cystic fibrosis. J Clin Microbiol, 1996, 34∶1129-1135.

　　2　Pitt TL. Epidemiological typing of Pseudomonas aeruginosa. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 1988, 7∶ 238-247.

　　3　Schwartz DC，Cantor CR. Separation of yeast chromosome-sized DNA by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell，1984, 37∶67-75.

　　4　Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol，1995, 33∶2233-2239.

　　5　Allardet-Servent A, Bouziges N, Carles-Nurit MJ, et al. Use of low-frequency-cleavage restriction endonucleases for DNA analysis in epidemiological investigations of nosocomial bacterial infections. J Clin Microbiol，1989, 27∶2057-2061.

　　6　Matushek MG, Bonten MJM, Hayden MK. Rapid preparation of bacterial DNA for pulsed-field gel electrophoresis. J Clin Microbiol, 1996, 34∶ 2598-2600.

　　7　Struelens MJ, Schwam V, Deplano A.Genome macrorestriction analysis of diversity and variablity of Pseudomonas aeruginosa strains infecting cystic fibrosis. J Clin Microbiol,1993,31∶2320-2326.

　　8　LeCler JE, Baoguang Li， William LP.High mutation frequencies among Escherichia coli and salmonella pathogens. Science,1996,274∶1208-1211.

(收稿：1998-05-30　　修回：1998-09-28)