单核细胞在含内毒素的微环境中分化时表型与功能的改变

单核细胞在含内毒素的微环境中分化时表型与功能的改变

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 基础免疫学

作者：侯凡凡　张训　陈平雁

单位：侯凡凡 张训（510515，第一军医大学南方医院肾脏科，中国人民解放军肾病中心）；陈平雁（第一军医大学统计学教研室）

关键词：单核-巨噬细胞；脂多糖；内毒素

　　【 摘要 】　目的　观察单核细胞在含内毒素(LPS)的微环境中分化成巨噬细胞时，其表型与功能的变化。 方法　以含LPS的介质体外培养纯化的正常人循环单核细胞，在其分化为巨噬细胞的不同阶段观察形态、超微结构、细胞表面HLA-DR、补体3受体(C3R)和甘露糖受体(MR)的表达以及细胞分泌超氧离子(O^-₂)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的变化。 结果　与在自身血清中分化的巨噬细胞相比，(1) 在含LPS介质中发育的巨噬细胞体积较小，但具有正常巨噬细胞的超微结构特征；(2) 在分化早期 (第1天)，其HLA-DR的表达明显上调，而在成熟阶段(第5天)表达下调。LPS对C3R和MR的表达无明显作用；(3) 在含LPS介质中分化的巨噬细胞，其在佛波醇肉豆蔻乙酸盐刺激下生成O^-₂的能力得以保持。自发分泌IL-1β和TNF-α的水平明显高于在血清中分化的巨噬细胞。 结论　在含LPS微环境中分化的巨噬细胞具有与正常单核细胞衍生的巨噬细胞所不同的功能特征，表现为MHCⅡ类抗原的表达降低，促炎症介质的生成增加。

Phenotypic and functional characteristics of macrophages differentiated in endotoxin-containing environment

HOU Fanfan

　　（Department of Nephrology, Nanfang Hospital, Guangzhou 510515,P.R.China）

　　ZHANG Xun, CHEN Pingyan

　　【 Abstract 】　Objective　To further understand the macrophage heterogeneity in the infection and inflammation, we characterized the phenotype and functional behavior of human monocytes differentiated in endotoxin (LPS)-containing cultures. Methods　Purified human peripheral monocytes were cultured with medium containing 1μg/ml of LPS. Their ultrastructure, expression of membrane antigens and production of superoxide and the cytokines were determined at various stages of their differentiation. Results　Monocytes cultured with LPS underwent substantial changes in morphology similar to that observed when monocytes differentiated into macrophages. However, they exhibited different functional behavior from macrophages matured in autologous serum. The expression of HLA-DR was up-regulated in these cells at day 1 of culture, and down-regulated at day 5. Superoxide production in response to phorbol myristic acetate was maintained in LPS cultured macrophages, but declined with time in cells cultured with serum. Spontaneous secretion of tumor necrosis factor-α and interleukin-1β was higher in macrophages developed in LPS compared with those matured in serum. Conclusion　Human monocytes maintained in LPS-containing cultures exhibit differentiation-associated activation phenotype, which differs from that of normal monocyte-derived macrophages, characterized by decreased MHC classⅡ antigen expression and higher capacity for generation of proinflammatory mediators.

　　【 Subject words 】　Monocyte/macrophage; Lipopolysaccharide; Endotoxin

　　单核-巨噬细胞是机体抵御微生物感染的主要效应细胞。单核细胞参与抗感染和炎症反应的能力不仅取决于活化因子，也受其自身衰老速度的调节^〔1〕。正常情况下单核细胞在循环中仅生存1至3天，而后迁移至组织中分化成巨噬细胞或通过自发性凋亡而被清除。近年研究证实，内毒素成份脂多糖(LPS)能够防止单核细胞凋亡，从而延长这类细胞的生存期^〔2〕。由于单核细胞分化成巨噬细胞需要数天时间，因此延长单核细胞的生存期能够促进这类细胞分化成巨噬细胞。

　　单核细胞一旦分化成巨噬细胞，其表型和功能将发生明显改变。例如，单核细胞表达低水平的HLA-DR和C3R，而当其成熟为巨噬细胞后，这些功能性抗原或受体的表达明显增强。相反，单核细胞遭受刺激时可生成大量超氧离子(O^-₂)和白细胞介素-1β(IL-1β)，而这些功能随其成熟为巨噬细胞而明显减弱^〔3〕。当机体遭革兰氏阴性菌感染时，单核细胞暴露于感染局部的内毒素，这类在含内毒素微环境中分化的巨噬细胞是否具有和正常单核细胞衍生的巨噬细胞相同的功能目前尚不清楚。本文旨在探讨LPS是否影响与分化有关的巨噬细胞的表型和功能。

　　材料与方法

　　人类单核细胞的纯化与培养：以6％葡聚糖和Ficoll-Hepaque梯度离心从健康自愿者全血中分离单个核细胞，再用Vario MACS系统(美国Milienvi Bioiec产品)，按厂方说明书用CD14免疫磁性阳性选择法纯化单核细胞。FACScan流式细胞仪鉴定分离的单核细胞，最终纯度＞99％(CD11C⁺, CD25^-)。将纯化的单核细胞混悬于含10％自身血清、20mmol/L L-谷氨酰胺、25mmol/L HEPES的RPMI 1640中。实验组同时在培养介质中加入终浓度为1μg/ml的LPS(Sigma产品)。细胞置24孔培养板中(10⁶/孔)，在37℃、5％ CO₂孵育箱中培养。

　　形态学和超微结构检查：单核细胞在24孔培养板上贴附生长1h(0d)至5d，用倒置显微镜观察形态学变化。在培养终点，用Versene 1/5000(美国GIBCO产品)使细胞脱离孔壁。收获的细胞用1.25%戊二醛固定，1％四氧化锇后固定，超薄切片，透射电镜观察。

　　细胞表面抗原与受体分析^〔4〕：单核细胞贴附培养1h至5d后，按上法收获细胞，与单克隆抗人HLA-DR、抗C3R、抗MR及亚型匹配的对照抗体(均为美国PharMingen产品)在冰浴中孵育60min，而后再与FITC结合的大鼠抗小鼠Ig κ轻链(PharMingen产品)反应45min。用FACScan流式细胞仪分析平均荧光强度(MFI)和向前散射光(FSC)。

　　超氧离子测定：单核细胞在佛波醇肉豆蔻乙酸盐(PMA)刺激下生成O^-₂的能力，按文献〔5〕方法用细胞色素C底物法测定。所用PMA、还原型细胞色素C和超氧化物歧化酶均为Sigma产品。

　　TNF-α和IL-1β定量分析：单核细胞贴附生长1h至5d。细胞单层用PBS洗2遍，换入含或不含1μg/ml LPS的新鲜培养液继续培养18h。收获上清，400×g离心5min，同时用上述方法收获并计数细胞。上清液中TNF-α和IL-1β的含量按厂方说明书用ELISA试剂盒检测(美国Endogen产品)。

　　统计学处理：实验均重复3次以上。数据处理用析因分析及多重比较的SNK法，两样本t检验及完全随机设计的方差分析。经SPSS7.5统计软件处理。统计学处理由第一军医大学统计学教研室完成。

　　结果

　　1.形态学和超微结构：单核细胞在含自身血清的介质中培养5d后体积较新鲜分离的细胞明显增大，超微结构显示典型的成熟巨噬细胞特征如胞浆足突增厚，吞饮小泡增多，胞浆出现晶体包涵体和次级溶酶体等。在含LPS介质中分化的细胞具有相似的形态学和超微结构改变，但体积较在不含LPS介质中分化的巨噬细胞略小(图1)。台盼蓝染色证实，所有培养孔中拒染细胞均≥95％。

　　2.表面抗原和受体的表达：新鲜分离的单核细胞表达HLA-DR(图2)。细胞与LPS共同培养1d后，HLA-DR的表达增加了1.7倍，而在不含LPS介质中培养的单核细胞，此时HLA-DR的表达无明显改变。经5d培养后，在含LPS介质中培养的细胞HLA-DR的表达较新鲜分离的单核细胞减少了4.8倍，而在不含LPS介质中培养的细胞HLA-DR的表达增加了1.8倍(表1)。

　　图2　单核细胞膜抗原的表达

　　Fig 2. Membrane antigen expression on monocytes

　　Freshly isolated monocytes were cultured for 1 h (Day 0) to 5 days with RPMI 1640-10% autologous serum in the presence or in the absence of 1μg/ml of LPS. The cells were washed and reacted with McAb against human HLA-DR, MR and C3R (filled peaks) or with the isotype control McAb (unfilled peaks).

　　新鲜分离的单核细胞亦表达C3R，但不表达MR。经5d培养后，在含与不含LPS介质中培养的细胞其C3R和MR的表达均较新鲜分离的细胞增加(表1)。

　　图1　单核细胞的形态和超微结构改变

　　Fig 1. Morphologic and ultrastructural characteristics of monocytes

　　A and D: Fresh isolated monocytes; B and E: Monocytes cultured for 5 days with RPMI 1640-10% autologous serum; C and F: Monocytes cultured for 5 days with medium containing 1μg/ml of LPS. All cell preparations, which were from the same donor, were photographed with a 20× phase-contrast objective on a inverted microscopy (A, B & C), then harvested and examined by transmisson electron microscopy (D, E & F)

表1　单核细胞表面膜抗原的表达

　　Table 1. Membrane antigen expression on monocytes^*

Treatment	MFI(tested McAb/isotype control)			FSC(size)
	HLA-DR	C3R	MR
Day 0	5.8	5.4	0.8	342
Day 1
Medium alone	5.9	5.4	0.9	356
LPS	9.9	5.4	1.0	348
Day 5
Medium alone	10.6	10.8	1.8	566
LPS	1.2	7.8	1.7	482

　　* Monocytes were cultured for 1 h (Day 0) to 5 days in RPMI 1640 with 10% autologous serum in the presence or in the absence of LPS (1μg/ml). The data are expressed as mean of triplicate cultures

　　MFI: mean fluorescence intensity　　3.超氧离子的生成量：单核细胞分化为巨噬细胞后其生成O^-₂的能力明显降低^〔4〕。如图3所示，在不含LPS介质中培养的细胞随孵育时间延长，其在PMA刺激下生成O^-₂的能力逐渐下降，而在含LPS介质中分化的细胞，这种能力仍可保持。

　　4.TNF-α和IL-1β的生成量：单核细胞在含或不含LPS的介质中培养不同时间，而后洗涤细胞单层，换入含或不含LPS的新鲜介质继续培养18h。培养上清的细胞因子水平测定(表2)表明，新鲜分离的单核细胞能自发性生成少量TNF-α和IL-1β，在LPS刺激下上述细胞因子的生成量明显增多。单核细胞在不含LPS的介质中培养时，随培养时间延长，自发性分泌TNF-α和IL-1β的能力逐渐降低。培养5d后的细胞即便在LPS刺激下，其生成IL-1β的能力依然很低，而在LPS刺激下生成TNF-α的能力得以保持。在含LPS介质中分化的细胞自发性分泌TNF-α和IL-1β的能力亦随培养时间延长而降低，但其分泌水平高于经相同时间培养、在不含LPS介质中分化的细胞。在含LPS介质中分化的细胞当接受LPS的进一步刺激时，TNF-α和IL-1β的生成不再增加。

表2　单核细胞TNF-α和IL-1β的分泌量^*

　　Table 2. TNF-α and IL-1β levels in the supernatants from monocytes cultured with LPS^*

Treatment	Day 0		Day 1		Day 5
	TNF-α	IL-1β	TNF-α	IL-1β	TNF-α	IL-1β
Cultured without LPS
Medium alone	35.7±1.8	32.3±2.2	32.4±　3.2	30.9±2.6	18.3±2.1	1.4±0.2
LPS	152.6±4.3	147.8±7.8	156.4±11.6	145.1±4.2	152.0±2.1	2.0±0.4
Cultured with LPS
Medium alone	34.7±3.1	31.9±2.1	119.0±　7.8	111.7±　8.0	50.5±　3.8	13.9±1.7
LPS	152.4±8.5	150.2±5.8	113.1±11.3	109.7±15.2	41.9±11.5	12.3±1.8

　　* Monocytes were cultured for 1 h (Day 0) to 5 days in RPMI 1640-10% autologous serum with or without LPS. The cells were washed and incubated with fresh medium in the absence or in the presence of 1μg/ml of LPS for 18 h. The levels of TNF-α and IL-1β in the supernatants were quantitated by ELISA and expressed as pg/10⁴ viable cells　　The data are expressed as mean±s of triplicate cultures. Between culture time, P＜0.0001; with and without LPS, P＜0.0001; culture condition, P＜0.0001

　　图3　单核细胞O^-₂的生成量

　　Fig 3. Superoxide production by monocytes

　　Monocytes were tested for O^-₂ production in response to PMA (10ng/ml) after different times of culture

　　▲ monocytes cultured with 1μg/ml of LPS； ● monocytes cultured with RPMI 1640-10% serum. The data were expressed as mean±s of triplicate cultures

　　讨论

　　单核-巨噬细胞承担着重要的生理功能，包括抗原呈递、淋巴细胞活化、宿主抗感染反应等。然而炎症巨噬细胞的功能不同于正常巨噬细胞。例如，腹膜透析并发感染病人的腹腔巨噬细胞自发性分泌高水平的TNF-α和IL-1β。诸如这类感染性炎症时，病变局部常存在较高浓度的LPS，提示单核细胞在含LPS的微环境中可能会沿着特殊的分化途径发育成具有不同功能的巨噬细胞。以往研究证实，循环单核细胞在含人血清的介质中贴附培养3d以上可在体外分化成巨噬细胞。这种细胞与体内自血管中迁移而出，并在组织中分化成熟的巨噬细胞具有相同的表型和功能，故被认为是代表未受刺激的正常巨噬细胞的良好模型^〔2,6〕。采用这种模型作为对照，我们观察了在含LPS介质中发育的单核细胞在不同分化阶段的表型与功能变化。在我们的培养体系中，新鲜分离的单核细胞表达低水平的HLA-DR、C3R，但不表达MR。对照培养在分化早期(培养1d后)，上述受体的表达无明显改变，但在分化晚期(第5天)，随细胞体积增大上述受体的表达明显增加。然而，在含LPS介质中培养1d后细胞体积并无增大，但细胞HLA-DR的表达明显增加。相反，培养第5天的细胞该抗原的表达明显降低，甚至低于单核细胞表达的水平。这些结果表明，LPS能够调节MHCⅡ类抗原的表达，而调节效应(上调或下调)则取决于细胞的分化阶段。MHCⅡ类分子在启动免疫反应中起着重要作用，包括向辅助性T淋巴细胞呈递抗原和刺激异种反应等。已证实，T细胞活化的程度与抗原呈递细胞表达的MHCⅡ类分子的绝对水平密切相关^〔7〕。因此，LPS对单核细胞MHCⅡ类分子表达的调节作用及其对细胞分化状态的依赖性可能是局部炎症和免疫反应的一种重要调节机制。

　　释放反应性氧自由基和促炎症细胞因子是单核、巨噬细胞参与免疫、炎症反应的重要机制。随单核细胞发育成巨噬细胞，其生成O^-₂的能力逐渐降低，但当细胞在含LPS的微环境中分化成熟时，这种能力可以保持。成熟巨噬细胞自发生成TNF-α和IL-1β的能力亦较单核细胞明显降低。然而，在含LPS介质中培养的细胞，分化早期自发生成上述细胞因子的能力明显增强，当成熟为巨噬细胞时，尽管TNF-α和IL-1β的分泌较分化早期降低，但其分泌水平仍明显高于相同时间培养的对照细胞。在含LPS微环境中分化成熟的巨噬细胞具有较强的产生促炎症介质的能力。

　　上述结果表明，在含LPS微环境中分化的巨噬细胞呈现与正常单核细胞衍生的巨噬细胞所不同的活化表型，其功能特征的改变依赖于细胞的分化阶段。因此，感染局部的炎症反应不仅取决于LPS的存在，与局部成熟和非成熟巨噬细胞的比例也可能有关。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770349)

参考文献

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(收稿日期：1999-07-03)