IL-8、MCP-1、RANTES及其受体在树突状细胞中的表达与其趋化性

IL-8、MCP-1、RANTES及其受体在树突状细胞中的表达与其趋化性

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 基础免疫学

作者：朱可建　郑敏　Ulrich Mrowietz

单位：朱可建 郑敏（310009 杭州，浙江大学医学院附属第二医院皮肤科）；Ulrich Mrowietz（Department of Dermatology, University of Kiel, Germany）

　　树突状细胞(DC)是最有效的抗原提呈细胞，在激活静止的T细胞和启动T细胞依赖的免疫应答中起特殊作用。DC启动免疫反应的能力取决于它们特异的游走和向组织汇集的特点。趋化因子涉及很多免疫和炎症反应，根本上起化学吸附和对特殊类型白细胞起激活因子的作用^〔1〕。

　　本实验采用由人单核细胞衍生的树突状细胞(MoDC)作为研究对象。为阐明某些趋化因子在DC游走中的可能作用，我们检测了白细胞介素8(IL-8),单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和受激活调节的正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)和它们的受体(IL-8受体A和B、MCP-1受体A和B以及RANTES受体）以及一种新近确定的DC趋化因子DC-CK1的mRNA在MoDC分化过程中的动态表达，同时还分析了MoDC对IL-8、MCP-1和RANTES的游走反应。

　　材料与方法

　　细胞因子：人重组白细胞介素-4(IL-4)由德国Essex Pharma公司惠赠。人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)由奥地利Novartis Pharma公司提供。人重组IL-8、MCP-1和RANTES购自BioConcept公司。

　　MoDC培养：用Ficoll/Hypaque(Biochrom公司）梯度离心和反向淘洗离心法(J2-21M/E Beckman淘洗机）从正常人外周血（由德国基尔大学输血中心提供）获取并纯化单核细胞（经流式细胞仪检测CD14⁺细胞大于90%)。体外培养5d。培养液为含有10ng/ml IL-4和100U/ml GM-CSF的RPMI 1640(BioConcept公司)。

　　MoDC表达趋化因子及其受体mRNA的分析：用逆转录PCR技术扩增目的基因。DC-CK1引物序列自行设计并购自德国Pharmacia公司。其余趋化因子及其受体的引物由Bartel博士（德国基尔大学皮肤病医院）惠赠。内对照磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物由Schlueter博士（德国基尔大学皮肤病医院）惠赠。趋化因子及其受体表达的定量根据目的基因信号的强度/GAPDH信号的强度计算。信号的强度用扫描影象软件（Scanpack3.0)处理后确定。

　　趋化活性测定：用48孔趋化试验微孔板(Costar公司）测定IL-8、MCP-1和RANTES对MoDC的趋化活性。趋化板分上下两层，之间用无聚乙烯吡咯烷的滤膜(Costar公司）分隔。结果以趋化指数(CI)^〔2〕评价。CI=受趋化因子刺激后游走过滤膜的细胞的平均吸光度÷未经趋化因子刺激的随机游走过滤膜的细胞的平均吸光度。

　　结果与讨论

　　1.趋化因子及其受体在MoDC中的表达：于培养初始（单核细胞）、培养后4h、1d、2d、3d、4d和5d收获细胞。IL-8、MCP-1和RANTES在从单核细胞向树突状细胞的分化过程中持续表达，但表达强度不同，IL-8的表达强度有波动，MCP-1表达强度逐渐增强，而RANTES则逐渐降低。新鲜分离获得的单核细胞或培养2d之内的MoDC不表达DC-CK1，2d之后开始有DC-CK1的表达，3d之后明显表达。趋化因子受体包括IL-8受体A和B、MCP-1受体A和B以及RANTES受体在单核细胞向树突状细胞分化的过程中均有表达。

　　Zhou和Tedder^〔3〕报道，CD83⁺的DC可产生IL-8，它主要对中性粒细胞和T淋巴细胞有活性并可能在各种炎症性疾病中起关键介质的作用。CD34⁺细胞产生的DC表达MCP-1和RANTES，这两者是单核细胞、嗜酸性细胞和淋巴细胞的化学吸附因子，在慢性炎症性和过敏性疾病中起重要作用。本研究对MoDC表达趋化因子IL-8、MCP-1和RANTES作了动态检测，发现它们在单核细胞向DC分化的全过程中持续表达，但表达水平不同，这有助于DC与T细胞间的相互作用以及DC在炎症部位的聚集。

　　2.趋化因子对DC的趋化功能：虽然MoDC有IL-8受体的转录表达却不向IL-8游走。10^-8～10^-12mol/L的MCP-1和RANTES可诱导DC的定向游走反应。如图1所示，RANTES在浓度为10^-9和10^-10mol/L时对MoDC显示很强的趋化性，而MCP-1则相对较弱。

　　图1　IL-8、MCP-1和RANTES对MoDC的趋化功能

　　为了解DC游走和定位的特性，重要的是研究趋化因子受体在DC上的表达。我们用逆转录PCR技术分析发现，MoDC能表达IL-8、MCP-1和RANTES受体。然而，在趋化功能试验中，MoDC只对MCP-1和RANTES有游走反应而对IL-8却无。也有研究发现，DC虽有IL-8受体的转录表达却对IL-8无游走反应^〔4〕。同样，单核细胞表达IL-8受体A和B，但对IL-8无游走反应^〔5〕。原因有待研究。MCP-1对DC趋化性较弱，可能因为DC对MCP-1受体表达弱。RANTES不仅是T细胞、NK细胞、单核细胞也是DC的有效的化学吸附因子。而且，炎症的淋巴结表达的主要趋化因子是RANTES，它涉及DC募集到区域淋巴结的过程^〔6〕。我们的结果表明，MoDC既表达RANTES也表达其受体，更重要的是MoDC能向RANTES游走，这提示了DC在炎症部位聚集中的自分泌作用。

　　MoDC不仅表达未激活的T细胞的趋化因子DC-CK1,而且不同程度地表达激活T细胞的趋化因子IL-8、MCP-1和RANTES，更有意义的是MoDC对MCP-1和RANTES具有游走反应，提示了这些趋化因子能使DC与T细胞间相互作用从而引导免疫反应的启动。目前已开辟了将DC用于肿瘤和感染性疾病的免疫疗法的新领域，因此，将体外产生的DC输回到宿主体内时是否能游走到靶组织就至关重要，而趋化因子在此过程中至少起部分作用。所以，确定并克隆趋化因子可将它们与基于树突状细胞的免疫疗法一起应用于临床。

　　本课题在德国基尔大学皮肤病院单核细胞实验室完成

参考文献

　　1，Miller MD, Krangel MS. Biology and biochemistry of the chemokines: a family of chemotactic and inflammatory cytokines. Crit Rev Immunol, 1992,12:17-46.

　　2，Mrowietz U, Christophers E. Modulation of human monocyte functions during acute bacterial infection. Scand J Immunol, 1998，28:139-146.

　　3，Zhou LJ，Tedder TF. A distinct pattern of cytokine gene expression by human CD83⁺ blood dendritic cells. Blood, 1995,86:3295-3301.

　　4，Xu LL, Warren MK, Rose WL, et al. Human recombinant monocyte chemotactic protein and other C-C chemokines bind and induce directional migration of dendritic cells in vitro. J Leukoc Biol, 1996，60:365-371.

　　5，Sozzani S, Luini W, Borsatti A，et al. Receptor expression and responsiveness of human dendritic cells to a defined set of CC and CXC chemokines. J Immunol, 1997，159:1993-2000.

　　6，Challita-Eid PM, Abboud CN, Morrison SL, et al. A RANTES-antibody fusion protein retains antigen specificity and chemokine function. J Immunol, 1998，161:3729-3736.

(收稿日期：1999-11-29)