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用生物传感器测定重组人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的亲和力及抗原识别表位
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第3期第20卷 基础免疫学
作者：刘雪松 金伯泉 朱勇
单位：第四军医大学免疫学教研室
关键词：生物传感器；单克隆；抗体；肿瘤坏死因子；表位
【 摘要 】 目的 测定重组人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体的抗原识别表位及其亲和常数。 方法 借助于生物传感器技术进行抗原抗体相互作用的动力学分析。 结果 10株TNF-α单抗的亲和常数介于105～107 M-1之间，其中所测的5株抗体识别肿瘤坏死因子上3种不同的抗原表位。 结论 生物传感器在研究抗原抗体相互作用中确为一个理想的工具，适合于抗原抗体结合与解离的动力学分析及预测表位的构象关系。
Determination of affinities and antigenic epitopes of
recombinant human tumor necrosis factor-α with
monoclonal antibodies by biosensor
LIU Xuesong, JIN Boquan, ZHU Yong. Department of Immunology, Fourth Military
Medical University, Xi'an 710032，P.R.China
【 Abstract 】 Objective To determine the affinities of 10 monoclonal antibodies specific for recombinant human tumor necrosis factor-α and 5 monoclonal antibodies recognizing antigenic epitopes of TNF-α. Methods By using biosensor the affinities were measured by means of kinetic analysis, and the antigenic epitopes were determined subsequently. Results It was shown that the affinity constants of the antibodies ranged from 105 to 107M-1 and the antigenic epitopes could be categorized into 3 groups. Conclusion The biosensor is a ideal and powerful tool to facilitate the kinetic analysis of interaction between antigen and antibody and for prediction of conformational distribution of antigenic epitopes.
【 Subject words 】 Biosensor；Monoclonal antibody；Tumor necrosis factor; Epitope
生物传感器是一种实时监测生物大分子之间相互作用的新技术和新设备。借助于这一技术，可以动态观察抗原抗体之间结合与解离的平衡关系，较为准确地测定抗体的亲和力及识别抗原表位，帮助人们了解单克隆抗体特性，有目的地筛选各种具有最佳应用潜力的单抗，而且较常规方法省时、省力，结果也更为客观可信，在国外生物医学研究方面已有较广泛的应用，但在我国才刚刚起步。最近我们采用Affinity System公司生产的生物传感器IAsys plus，对本室制备的10株重组人肿瘤坏死因子-α（recombinant human tumor necrosis factor-α, rhTNF-α）单克隆抗体的抗原识别表位及其亲和常数进行了测定。结果表明，生物传感器在抗原抗体结合的动力学分析方面确有其独到之处。
材料和方法
rhTNF-α及其单克隆抗体的制备：rhTNF-α单克隆抗体杂交瘤由本室制备〔1〕。常规制备单抗腹水，40%饱和硫酸铵盐析后，经FPLC（Waters 650）上DEAE阴离子交换柱连续梯度洗脱、紫外检测收集蛋白峰，经SDS-PAGE和薄层扫描分析，其纯度达90%以上。rhTNF-α由中科院上海生物技术中心陈常庆教授惠赠，纯度达95%以上。
TNF-α抗原的包被：rhTNF-α包被样品池（cuvette）羧甲基葡聚糖（carboxymethyl dextran，CMD），预处理的样品池由Affinity System公司惠赠，按照产品手册及提供的NHS/EDC kit活化CMD上的羧基后，在第一个样品池中加入rhTNF-α（70μg/ml）和牛血清白蛋白（100μg/ml）各50μl，5min后用乙醇胺封闭空余羧基3min。然后用1mol/L甲酸洗去游离及非特异结合之蛋白分子。
生物传感器工作的原理和基本过程：简言之，生物传感器的工作原理是利用表面等离子共振（surface plasmon resonance）现象监测传感片表面介质的折射率变化，而这一变化仅与传感片表面结合的生物大分子的量成正比，溶液中的分子不会干扰，因此非常特异、敏感。用生物传感器检测任何生物大分子间相互作用都要经过结合-解离-再生几个步骤（图1）。以抗原-抗体为例，首先将包被好抗原的样品池放入生物传感器，平衡10min，①基线(baseline):加入pH7.2，0.01mol/L PBS 50μl，等待5min，作一平稳基线。②结合(association):吸去PBS，加入45μl PBS和5μl单抗，至单抗结合至饱和时吸去单抗液，③解离(dissociation):换50μl PBS，待单抗结合与解离达到平衡，④再生(regeneration):换20mmol/L HCl 50μl作用2min以完全洗脱结合的单抗，⑤回复基线:换PBS，再次回到基线，即可开始下一个循环。
抗原抗体结合的动力学分析：如前所述，将每种单抗用PBS稀释为4～5个不同浓度，依次分别测定各浓度单抗与包被抗原的结合、解离速率，并通过随机附送之专用软件FASTfit计算各株单抗的亲和常数。
表1 TNF-α McAbs的特性鉴定
Table 1. Characterization of McAbs to rhTNF-α
| McAb | Ig subclass | Titer* | Affinity△ | Neutralization activity# | Binding with native TNF-α |
| B5 | IgG1 | 10-6 | 9.9×106 | 4.0×105 | ND |
| C4 | IgG2b | 10-6 | 9.1×106 | 1.0×106 | + |
| D2 | IgG2b | 10-6 | 7.3×105 | 1.0×106 | + |
| D12 | IgG1 | 10-7 | 6.9×106 | - | + |
| E6 | IgG1 | 10-7 | 1.4×106 | 1.0×106 | + |
| E11 | IgG1 | 10-5 | 5.6×106 | - | + |
| F6 | IgG1 | 10-7 | 1.5×106 | 4.0×106 | + |
| F8 | IgG1 | 10-5 | 1.1×106 | 1.0×105 | ND |
| G9 | IgG1 | 10-7 | 3.6×105 | 4.0×104 | ND |
| G11 | IgG2a | 10-7 | 4.9×107 | - | + |
*Titer of McAb in ascite by ELISA; △ Affinity constant of mcAb; # Activity TNF-α(unit) neutralized by 1mg of McAb; ND: Not done
图1 生物传感器检测生物大分子间相互作用的基本过程
Fig 1. Typical working cycle of biosensor
b. Baseline; a. Association; d. Dissociation; r. Regeneration
抗原识别表位测定：在抗原抗体结合动力学分析的基础上，将每株单抗均稀释为中等饱和结合浓度，两两配对，首先在平衡好的样品池中加入No.1 Ab，经结合、解离后，再加No.2 Ab，继续结合、解离过程，再生后进行下一循环，并将No.1和No.2 Ab作用顺序调换，重复进行上述步骤。
结果
1.pH5.0条件下rhTNF-α包被效果最好：经试用pH3.0～6.0 4种不同pH值、10mmol/L的乙酸钠缓冲液进行预包被，发现pH5.0包被缓冲液最利于rhTNF-α与CMD样品池的偶联。生物传感器测定值为1200arc seconds，相当于样品池每mm2表面包被了6.0ng rhTNF-α。
2. 10株单克隆抗体的亲和力及其结合、解离特点：图2显示了F6单抗在4种不同浓度（3.125×10-6mol/L、6.25×10-6mol/L、3.125×10-7mol/L和9.375×10-7mol/L）时的结合与解离的动态变化。从所得动态曲线采集数据，经FASTfit分析计算10株单抗的亲和常数（见表1）。同时，结果显示10株单抗均不与BSA结合，表明该系统特异性良好。
图2 单克隆抗体F6与rhTNF-α相互作用的动力学曲线
Fig 2. Kinetic analysis of interaction between rhTNF-α and monoclonal antibody F6
3.rhTNF-α分子上抗原表位至少有3种：图3显示了单抗E6与F6；F6与D2和F6与D12两两配对时，用生物传感器测定它们识别rhTNF-α抗原表位的情形。图4为5株单抗两两配对时相互拮抗关系的示意图，图中0为第二抗体的结合完全被阻断。如图3A所示，E6可以阻断F6与抗原的结合，反过来也是如此，提示E6、F6单抗识别表位相同或相近；图中+表示后加的第二种抗体仍可结合，如图3B所示，F6不能阻断D2与抗原的结合，反之亦然，提示D2、F6单抗识别表位不同。值得注意的是，有一些抗体两两配对时的结合顺序不同，出现的结果也不同。如图3C，单抗D12能阻断F6单抗与抗原的结合；而反过来F6不能完全阻断D12与抗原的结合。这种情形提示，这两株单抗识别的抗原表位不同，但相距较近。在构象关系上，F6识别表位可能位于抗原分子折叠的凹陷处，D12识别表位位于其上方。从图3单抗与抗原结合解离的曲线图形上也可看出表位相同与否。根据Venn diagram作图，得到了图5所示的抗原表位识别图谱，5株单抗识别rhTNF-α分子上至少3种表位，其中B5、E6和F6为一组，D2和D12各自独立为一组。
图3 rhuTNF-α分子上抗原识别表位的测定
Fig 3. Antigenic epitope mapping of rhTNF-α
Note: 1. McAb E6; 2. McAb F6; 3. McAb D2; 4. McAb D12
图4 生物传感器对单抗识别rhTNF-α表位配对测定
Fig 4. Pairwise antigenic epitope mapping of rhTNF-α by biosensor
图5 rhTNF-α分子上抗原表位图谱
Fig 5. Venn diagram representing antigenic epitope map of rhTNF-α
讨论
生物传感器的应用范围十分广泛，除了抗原-抗体以外，还可以进行配体-受体〔2〕、核酸-核酸、核酸-蛋白〔3〕、细胞〔4〕、噬菌体〔5〕，甚至碳水化合物和脂类分子等的相互作用研究。与常规技术相比，它具有以下几个主要特点：①实时(real time)性。生物分子之间的相互作用可以在实验的全过程中观察，每秒钟可以做3次记录。②高效性。检测一对生物大分子的相互作用只需20min左右。③客观性。实验结果受人为因素影响较小。④敏感性。检测分子的浓度在10nmol/L。⑤简易性。检测中的任何分子无需标记。其中实时性是该技术不可替代的优势〔6〕。以往我们采用常规方法，如ELISA、RIA等分析抗原-抗体结合情况，只能在实验结束后方可判定结果，做出“是”或“否”的结论。抗原-抗体相互作用的中间过程不得而知，当实验出了差错或得出意外结果时，也很难一下找出问题所在步骤。而生物传感器技术则可一目了然地全过程跟踪、观察。
准确地测定抗体的亲和常数一直是比较棘手的事情，常规方法需要大量抗原，耗时费力。生物传感器配合其专用软件可在1h内测定1株抗体的亲和常数。而且同时测定多株抗体的亲和常数误差小，更具可比性。其独到之处还在于生物传感器技术不仅可对一组抗体的亲和力进行比较，而且能直观反映一组抗体与相应抗原结合与解离的速率，这个特性对于筛选不同应用目的的抗体、优化组合非常有用，比如，用于检测、诊断的抗体的亲和力越高越好，同时与抗原的结合要快、而解离则要慢和少。在我们制备的10株单抗中，以E6和G11株单抗在免疫组化染色的应用中效果最好〔7，8〕，由于单抗亲和力高、稀释度大，故染色的背景清晰，阴阳性结果非常清楚。E6在用于不同类型疾病动物模型的保护实验中也获得了较满意的结果〔9〕。在梁敏等用我们制备的单抗F6作亲和免疫吸附柱经体外循环清除血液中TNF-α的实验中也验证这一点。由于亲和力高、结合快、解离少的单抗一旦结合TNF-α，就不会让它掉下来再进入血液中，所以这类单抗更适合用于作清除和中和体内的TNF-α之用〔10〕。这些结果与生物传感器测得的亲和力的结果相吻合，所用3株单抗的亲和力也是最高的。而用于抗原分子亲和层析纯化的抗体除了要有高的亲和力，其解离也要比较容易。在亲和层析技术中应用生物传感器还能帮助选择合适的洗脱条件。
确定一组单抗识别抗原表位多采用竞争ELISA方法，需要酶标每株抗体，工作量很大，通常10株单抗的表位鉴定至少需要1～2周时间。而应用生物传感器则可在24h内完成。从图4和图5分析表位的结果与我们用竞争ELISA测定结果是一致的。分别测出D2与F6识别不同的表位，以此为依据我们成功地建立了夹心ELISA检测TNF-α的方法，其检测敏感性达40pg/ml。目前已被广泛用于临床标本的检测和基础研究。用生物传感器测定表位则更为精确，其结果甚至可以帮助我们初步了解几个表位在抗原分子上的空间构象关系。在选择用于夹心ELISA的最佳抗体组合上也具有很大的实际价值。
志谢：感谢Affinity System公司Andrew Au先生给予技术指导。
参考文献
1 刘雪松, 金伯泉，许辉，等. 抗重组人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的研制及其初步应用. 单克隆抗体通讯, 1995, 11（2）:8-11.
2 Ozbek S, Grotzinger J, Krebs B, et al. The membrane proximal cytokine receptor domain of the human interleukin-6 receptor is sufficient for ligand binding but not for gp130 association. J Biol Chem, 1998, 273(33):21374-21379.
3 Yang WP, Wu H, Barbas CF, et al. Surface plasmon resonance based kinetic studies of zinc finger-DNA interactions. J Immunol Methods, 1995, 183(1):175-182.
4 Inoue K, Arai T. Real-time observation of binding of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) to vero cells and neutralization of HSV-1 by sulfonated human immunoglobulin. J Biochem, 1997, 121:633-636.
5 Krebs B, Griffin H, Winter G, et al. Recombinant human single chain Fv antibodies recognizing human interleukin-6. Specific targeting of cytokine-secreting cells. J Biol Chem, 1998, 273(5):2858-2865.
6 Garland PB. Optical evanescent wave methods for biomolecular interactions. Quarterly Reviews of Biophysics, 1996, 29(1):91-117.
7 王新, 许才绂, 赵国宁，等. TNF-α、IL-6和IL-8与慢性肝病的关系. 中华传染病杂志, 1997, 15(2):85-88.
8 席宏丽, 王勤环, 斯崇文，等. IL-1β、IL-6和TNF-α在乙型肝炎患者肝组织中的表 达. 中华传染病杂志, 1997, 15(2):98-99.
9 陈岳祥, 黄裕新, 许才绂,等. 抗rhTNF-α单克隆抗体对急慢性肝细胞损伤和纤维化保护作用的实验研究. 国家自然科学基金委员会生命科学部，第一届生命科学青年学术研讨会摘要, 北京: 中国农业科技出版社, 1993, 56.
10 梁敏, 张训, 侯凡凡. 免疫吸附清除循环肿瘤坏死因子对内毒素休克的保护作用. 中华肾脏病杂志, 1996, 12(5):289-291.
(收稿日期：1999-06-28)