绿色荧光蛋白与H-2Kb融合基因的构建及表达

绿色荧光蛋白与H-2Kb融合基因的构建及表达

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第3期第20卷 基础免疫学

作者：钱书兵　陈诗书

单位：上海第二医科大学生物化学教研室

关键词：主要组织相容性复合物；绿色荧光蛋白；融合分子

　　【 摘要 】　目的　构建GFP与H-2K^b融合基因，并分析融合基因在活细胞中的表达。 方法　应用基因工程技术构建H-2K^b与绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因。RT-PCR和Western印迹分析基因表达；激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞内荧光布局。 结果　RT-PCR和Western印迹分析表明融合基因获得了正确表达。激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明，K^b-GFP融合分子象天然K^b分子一样表达在细胞膜表面，且胞外区域可被K^b分子特异性单克隆抗体所识别，表明K^b-GFP融合分子可在细胞内正确折叠和装配。K^b-GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果。 结论　K^b-GFP融合蛋白具有GFP的自发荧光特性，且不影响K^b分子在细胞内的正确表达。

Construction and expression of H-2K^b cDNA fused with

　　green fluorescent protein gene

QIAN Shubing, CHEN Shishu. Department of Biochemistry, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, P.R.China

　　【 Abstract 】　Objective　To construct a fused gene of H-2K^b and green fluorescent protein, and analyze the expression of fused K^b-GFP in living cells. Methods　A fusion gene composed of green fluorescent protein (GFP) and murine class I MHC molecule H-2K^b cDNA was constructed by standard cloning technology. Northern blot and Western blot analysis were used to evaluate the expression of the fused gene. Laser-scanning confocal microscopy was used to monitor the distribution of green fluorescence. Results　Laser-scanning confocal microscopy clearly revealed that the chimeric K^b-GFP molecules were mostly expressed on the membrane surface as the natural counterpart. Furthermore, the extracellular portion of the expressed K^b-GFP conjugate can be recognized by a monoclonal antibody specific for folded K^b molecule, implying the correct folding and assembly of GFP tagged K^b molecules. K^b-GFP can be transiently and stably expressed in mammalian cells. Conclusion　The GFP tag does not interfere with the natural assembly and transport of K^b molecule, and K^b-GFP can act as a potential tool to learn more about antigen presentation by class I MHC molecules in living cells.

　　【 Subject words 】　Major histocompatibility complex; Green fluorescent protein; Fusion construct

　　主要组织相容性复合物（MHC）编码的Ⅰ类分子分布在所有有核细胞表面，用以将细胞内经过加工的肽段提呈到细胞表面，由免疫效应细胞识别。表达在细胞表面的Ⅰ类分子复合物由一条相对分子质量为45×10³的重链、12×10³的可溶性β₂m和8～10个氨基酸残基组成的抗原肽组成。这3种成份对Ⅰ类分子在细胞内的有效转运及在细胞膜表面的稳定表达是必需的^〔1-3〕。已经知道Ⅰ类分子复合物在内质网（ER）中的正确装配尚需要其它辅助因子的参与，而内质网中存在的质量控制机制将确保只有正确折叠的分子才表达出去^〔4〕，但对其详细的内在机制尚未完全阐明。

　　用绿色荧光蛋白（GFP）作为蛋白质标记可在活细胞中观察MHCⅠ类分子复杂的转运过程。本研究中，我们将GFP的氨基端连接到小鼠MHCⅠ类分子H-2K^b的羧基端。在真核细胞中瞬间和稳定表达后，可见融合分子的绿色荧光集中于膜表面和内质网区。和正常Ⅰ类分子一样，膜表面表达的K^b-GFP嵌合分子可被K^b特异性的单克隆抗体AF6-88.5.3所识别。因此有功能的K^b-GFP分子可用于进一步研究Ⅰ类分子在活细胞中的装配和转运过程。

　　材料和方法

　　K^b-GFP融合基因的构建：H-2K^b全长cDNA是从C57BL/6小鼠脾脏细胞中应用逆转录PCR反应扩增获得。上游引物（K^b5）为：5′-TAGGATCCATGGTACCGTGCACGCTGCTCCTG CTGT-3′，在起始密码ATG前加入了BamHⅠ位点；下游引物(K^b3）为：5′-CGGTCGACTCAAAGCTTCGCTAGAGAATGAGGGTC-3′，在终止密码TCA两侧分别引入了HindⅢ位点和SalⅠ位点。H-2K^bcDNA通过BamHⅠ和SalⅠ克隆入pBluescriptⅡ SK⁺载体中，构建成pBluescript/K^b并经测序验证。为构建K^b-GFP融合基因，首先应用HindⅢ和XbaⅠ将全长GFP从质粒载体phGFP-S65T中酶切下来，再克隆入经相同酶切的pBluescript/K^b中，这样K^b的终止密码TCA被切除，并且K^b在同一阅读框架上连接GFP。在瞬间表达研究中，融合的K^b-GFP片段通过BamHⅠ/XhoⅠ克隆入真核表达质粒pcDNA3中，构建成pcDNA3/K^b-GFP。在长期稳定表达研究中，K^b-GFP片段5′补平，3′用XhoⅠ酶切，克隆入双顺反子逆转录病毒载体pGCEN中，构建成pGCEN/K^b-GFP。

　　DNA转染和重组逆转录病毒转导：COS7细胞置于6孔板中的盖玻片上进行培养，当长至80%满时，每孔分别用1μg质粒DNA和10μl脂质体LipofectAMINE（GIBCO）进行转染。简言之，COS7细胞在无血清培养基中与DNA-脂质体复合物共培养6h，加入完全培养液，继续培养48h后进行分析。在逆转录病毒转导中，首先应用脂质体介导方法将重组质粒pGCEN/K^b-GFP转导入双嗜性包装细胞PA317中。G418抗性克隆的培养上清收集后用0.45μm滤膜过滤备用，病毒上清滴度测定为5×10⁴～2×10⁶CFU/ml之间。靶细胞转染时，取生长状态良好的小鼠肝癌细胞MM45T.Li，加入含重组逆转录病毒上清及终浓度为8μg/ml的polybrene（Sigma）。转导细胞在选择培养基中筛选培养约2周，挑选单克隆进行扩增分析。

　　RT-PCR：细胞总RNA抽提按TRIzol^○　R试剂盒（GIBCO）推荐方法进行，并将RNA沉淀溶于DEPC水中。按下列建立逆转录反应体系20μl：首先在6μl DEPC水中加入细胞总RNA约5μg，RNasin 0.5μl, 随机引物2μl，混匀。在65℃中变性5min后置冰浴。再加入5×反应缓冲液4μl，10mmol/L dNTP 1μl，RNasin 0.5μl及0.1mol/L DTT 0.5μl，最后加入MoMLV逆转录酶1μl(200U)，混匀后，置37℃水浴1.5h。在95℃中变性5min终止反应后备用。PCR引物除了上述K^b5和K^b3用于扩增K^b片段(1.1kb)外，还应用GFP5：5′＞TAGAATTCATGGTGAGCAAGGCGAGGAGCT

　　G＜3′及GFP3：5′＞GATCTAGAGTCGCGGCCGCTTTAC

　　TTGTACAG＜3′扩增GFP片段(747bp)；β-actin5：5′＞CTCTTTGATGTCAAGCACGATTTC＜3′及β-actin3：5′＞GTGGGCCGCTCTA GGCACCAA＜3′ 扩增β-actin片段(666bp)。PCR反应条件为：先94℃ 5min，60℃ 5min，续接72℃ 2min，94℃ 1min和60℃ 1min，共进行35次循环，最后附加72℃延伸10min。

　　Western印迹分析：培养细胞用冰冷的PBS洗2次后，加入裂解缓冲液，内含pH7.4的50mmol/L Tris-Cl, 150mmol/L NaCl, 1%CHAPS（Pierce）, 100μg/μl PMSF, 1μg/μl aprotinin, 1μg/μl leupeptin (Calbiochem)。冰浴30min后，将裂解物以12000×g离心5min，收集上清。在12% SDS-PAGE上进行分离后，电转移至硝酸纤维薄膜上。5% BSA封闭30min后，将薄膜与兔抗GFP多抗（Clonetech）室温孵育1h。用50mmol/L Tris-Cl/1%Tween-20洗膜3次后，与生物素标记的抗兔IgG抗体（华美）室温孵育1h。洗膜后，再加入亲和素和生物素化辣根过氧化物酶（Vector）进行室温孵育1h。最后用ECL试剂（Amersham）检测结果，并曝光于X光片上。

　　共聚焦荧光显微镜检测：将细胞在盖玻片上进行培养后，用激光共聚焦荧光显微镜（Zeiss LSM510）进行荧光分析。为检测细胞表面表达的K^b分子，应用K^b分子特异性的单克隆抗体AF6-88.5.3进行间接免疫荧光染色，并用藻红素（PE）标记的抗鼠抗体(Sigma)作为二抗。抗体孵育条件为4℃ 30min，每次均用含0.02%叠氮钠和1%牛血清白蛋白的PBS洗3次。结果采用多通道进行观察GFP的绿色荧光和PE的红色荧光，并进行通道叠加分析，数字化图像采用Photoshop软件进行转换和输出。

　　流式细胞检测：为分析逆转录病毒载体介导的GFP在MM45T.Li中的表达，细胞样品采用上述相同方法进行间接免疫荧光染色。应用FACScan在488nm激发下，分别于530±30nm处观察GFP荧光和575±26nm处观察PE荧光。

　　结果

　　1.K^b-GFP融合基因的构建：应用PCR技术，在K^b终止密码TCA前引入了HindⅢ酶切位点。通过酶切连接反应，将全长GFP基因在同一阅读框架上与K^b基因相连，同时K^b的终止密码被去除。这样融合基因表达的完整蛋白质分子包括信号肽、全长K^b及GFP分子，连接区由HindⅢ酶切位点形成的Lys-Leu组成。融合的K^b-GFP基因进一步被克隆入真核表达载体pcDNA3和双顺反子逆转录病毒载体pGCEN中（图1）。重组pcDNA3载体的酶切鉴定结果表明重组载体含有正确的融合基因片段（图2）。

　　2.K^b-GFP融合基因的表达：应用脂质体介导，将重组pcDNA3载体转染到COS7细胞中。3天后抽提细胞总RNA，进行RT-PCR分析。如图3所示，应用K^b和GFP引物可分别扩增出相应的插入基因片段；应用K^b上游引物和GFP下游引物，则可扩增出1.8kb的K^b-GFP融合基因片段。进一步应用Western印迹分析融合蛋白的表达，图4结果表明，K^b-GFP融合基因可表达出相对分子质量为72×10³的融合蛋白，与预期相符。

图1　Kb-GFP融合基因结构(A)及含Kb-GFP重组载体结构(B)示意图 　　Fig 1. Domain structure of Kb-GFP conjugate(A), Schematic structures of recombinant vectors containing Kb-GFP conjugate(B)

　　图2　重组pcDNA3载体酶切示意图

　　Fig 2. Identification of recombinant pcDNA3 using restriction enzyme digestion

　　M. λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ; 1. XbaⅠ; 2. XbaⅠ+BamHⅠ; 3. XbaⅠ+HindⅢ　　

　　图3　转染COS7细胞的RT-PCR结果

　　Fig 3. RT-PCR results of transfected COS7 cells

　　M. λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ; 1. COS7/GFP; 2. COS7/K^b; 3. COS7/K^b-GFP

　　图4　转染COS7细胞的Western印迹分析结果

　　Fig 4. Western blot analysis of transfected COS7 cells

　　1. COS7/GFP; 2. COS7/K^b-GFP; 3. COS7/K^b

　　3.K^b-GFP融合基因的荧光检测：由于GFP在蓝光激发下可自发绿色荧光，故可方便地通过观察K^b-GFP融合蛋白在细胞内的荧光布局，来分析该融合分子在活细胞中的转运途径。在普通荧光显微镜下，K^b-GFP转染的COS7细胞具有与GFP转染细胞完全不同的荧光布局，前者主要集中于细胞膜表面和核膜区域；而后者则均匀分布于整个细胞浆中。进一步应用激光共聚焦荧光显微镜进行观察，发现K^b-GFP转染的COS7细胞，其绿色荧光主要分布于细胞膜表面和核膜周边区域（图5）。

　　图5　转染COS7细胞的荧光分析

　　Fig 5. Evaluation of green fluorescence in transfected COS7 cells

　　A. COS7/GFP; B. COS7/K^b-GFP

　　尽管以上结果表明，在细胞内表达的K^b-GFP融合分子能通过ER中的质量控制机制，并转运至细胞膜表面，但仍然不清楚融合蛋白质中的K^b分子是否能形成正确的构象。为探究这个关键问题，我们应用K^b分子特异性的单克隆抗体进行了多通道荧光分析。细胞首先用特异性单抗AF6-88.5.3进行标记，继之用PE二抗进行间接免疫荧光染色。在488nm激发光下，K^b-GFP转染的COS7细胞既可见GFP绿色荧光，又可见PE红色荧光。将这两种荧光信号进行叠加后，出现明显的黄色（图6），表明这两种荧光信号位于同一区域。由此可见，GFP标记并不影响K^b分子在细胞内的正确折叠和转运。

　　图6　转染COS7细胞的多通道荧光分析

　　Fig 6. Multi-channel fluorescence observation in transfected COS7 cells

　　A. Red fluoresecnec channel; B. Green fluorescence channel; C. Superimposition of A and B

　　为了进一步分析K^b-GFP在细胞内的分布，应用双顺反子逆转录病毒载体将K^b-GFP融合基因转导至小鼠肝癌细胞MM45T.Li中。G418筛选后获得的抗性克隆显示出与K^b-GFP转导COS7细胞相同的荧光布局。此外，该转导细胞克隆经体外传代培养10次以上，经观察仍然保持这种荧光特性，这与逆转录病毒载体介导的K^b-GFP融合基因稳定整合至宿主细胞基因组中有关。这表明，GFP融合的Ⅰ类分子并不会对细胞本身造成毒害。此外，还应用流式细胞仪分析了逆转录病毒载体介导K^b-GFP转导的MM45T.Li细胞。如图7所示，MM45T.Li/ K^b-GFP均检测到红色和绿色荧光；而MM45T.Li/K^b仅有红色荧光，MM45T.Li/GFP仅出现绿色荧光。

　　图7　逆转录病毒载体介导MM45T.Li细胞的FACS分析

　　Fig 7. FACS dual-channel analysis of retrovirally transduced MM45T.Li cells

　　讨论

　　理想的GFP融合蛋白是既具有GFP的绿色荧光，又保持靶蛋白的生理功能。GFP的氨基端和羧基端均已被成功地连接到多种可溶性和穿膜型蛋白质上^〔5〕。GFP的晶体结构显示出其紧密的桶状型结构有助于保护其整体构象，因此较大蛋白质分子的连接不易影响其自发荧光功能^〔6,7〕。但相对分子质量为27×10³的GFP作为蛋白质标记是否会影响靶蛋白的功能则需精心设计。本研究中，GFP的完整阅读框架被连接到小鼠MHCⅠ类分子H-2K^b的羧基端（图1），这种设计使GFP分子距离组成Ⅰ类分子抗原结合槽的α1和α2功能区相对较远，影响较小。

　　应用传统生物化学方法已经初步阐明了MHCⅠ类分子装配和转运过程的某些环节。如重链、β₂m和抗原肽是Ⅰ类分子复合体在ER中完成装配并转运至细胞表面所必需的。许多未装配完全的Ⅰ类分子受到ER中存在的质量控制机制的制约而不能被转运至细胞表面，并在胞浆中降解。因此在本研究中，将K^b-GFP融合基因转染至真核细胞中表达后，可以方便地通过观察活细胞中K^b-GFP融合蛋白的绿色荧光布局，来分析该融合分子是否有正确的细胞内转运途径。

　　应用激光共聚焦荧光显微镜观察到K^b-GFP融合蛋白在COS7细胞中主要分布于细胞膜表面和核膜周边区域，这是由于ER是MHC分子表达至细胞膜表面的必经之路，且在细胞膜表面的表达表明K^b-GFP融合分子能够通过ER中存在的质量控制机制，提示K^b-GFP融合蛋白可形成正确的构象。更关键的是，我们应用K^b分子特异性的单克隆抗体进行了多通道荧光分析，结果表明，细胞膜表面表达的K^b-GFP融合分子能被该单克隆抗体所识别。应用双顺反子逆转录病毒载体将K^b-GFP融合基因转导至小鼠肝癌细胞MM45T.Li中，进一步证实了上述结果。

　　由于GFP的自发荧光特性，在蛋白质分子定位和观察细胞动力学行为等研究中已成为一种很有价值的生物标记分子^〔8-10〕。GFP作为蛋白质分子标记具有多种优势，其一，其自发荧光无需辅助分子、底物、抗体或其它试剂；其二，GFP荧光波长呈狭窄单峰，可利用其它波长来研究靶蛋白的特性；其三，容易在细胞内进行定位观察；最后是活细胞观察使研究靶蛋白在细胞内的功能成为可能。本研究中建立的K^b-GFP融合分子有助于了解MHCⅠ类分子在细胞中复杂的行为。阐明新合成的MHCⅠ类分子重链在ER内是如何与辅助分子相互作用的，将有可能了解抗原递呈过程在体内是如何被调节的。最近我们正应用该融合分子研究ER内多种因子与Ⅰ类分子之间的相互作用。

　　基金项目：国家自然科学基金（39800132）和上海市高校发展基金（98BJ01）资助项目

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(收稿日期：1999-03-17)