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识别胸腺髓质上皮细胞和胸腺树突状细胞的单链抗体的筛选
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 基因工程抗体
作者：姜宇飞 陈慰峰 Willem van Ewijk
单位：姜宇飞 陈慰峰（北京大学医学部免疫学系）；Willem van Ewijk（荷兰Erasmus大学免疫学系）
关键词：噬菌体展示；单链抗体；胸腺髓质上皮细胞；胸腺树突状细胞
【 摘要 】 目的 利用噬菌体展示技术寻找胸腺基质细胞表面的新抗原。 方法 用培养的胸腺基质细胞系MTDC作为靶抗原富集初级噬菌体抗体库，从经过富集后的次级抗体库中挑选克隆，制备单链抗体，并在冰冻切片及培养的细胞系上检测抗体的特异性。 结果 从经4轮富集的次级抗体库中挑选到一个新的克隆。用此克隆制备的单链抗体可同时辨认胸腺髓质上皮细胞亚群和胸腺树突状细胞亚群。 结论 胸腺髓质上皮细胞和胸腺树突状细胞均具有异质性，同时噬菌体展示技术可以作为寻找细胞表面新分子的强有力工具。
A new surface antigen shared by subsets of thymic medullary epithelial cells and thymic dendritic cells recognized by a novel single chain antibody
JIANG Yufei
（Department of Immunology, Beijing University Health Science Center, Beijing 100083, P.R.China）
CHEN Weifeng, Willem van Ewijk
【 Abstract 】 Objective To search for new antigens expressed on the surface of thymic stromal cells using phage display technology. Methods The primary phage library was selected with thymic dendritic cell line MTDC to obtain subtracted library. The positive clones were picked up from subtracted library and single chain antibodies were made from these clones. The reactivities of single chain antibodies were tested on mouse frozen sections and various mouse cultured cell lines. Results From the subtracted library of fourth round selection we obtained one new clone. Single chain antibody derived from this clone can recognize a new antigen expressed on the surface of subsets of both thymic medullary epithelial cells and thymic dendritic cells. Conclusion Both epithelial cells and dendritic cells are highly heterogeneous in thymic medulla. Phage display technology can be used as a powerful tool in searching for new antigens on thymic stromal cells.
【 Subject words 】 Phage display; Single chain antibody; Thymic medullary epithelial cell; Thymic dendritic cell
免疫系统发挥正常的生理功能需要功能正常的免疫细胞，免疫细胞的重要成分之一，T细胞主要是在胸腺中产生的〔1〕。胸腺前体细胞进入胸腺以后，通过与胸腺微环境中各种成分相互作用经历阳性选择与阴性选择而形成功能成熟的T细胞〔2〕。现在人们普遍认为胸腺皮质中的上皮细胞介导了阳性选择过程〔3〕，经过这一阶段，那些与自身MHC分子能够结合的胸腺细胞存活下来，下调CD4或CD8，进入胸腺髓质。髓质中这些功能并不十分成熟的单阳性细胞要在髓质区基质细胞的帮助下分化成功能完全成熟的单阳性细胞，包括上调表达H-2和Qa-2抗原〔4，5〕。目前，在髓质中的胸腺细胞的成熟过程还不是很清楚，但普遍认为阴性选择发生在髓质〔6〕。髓质中的基质细胞主要包括髓质的上皮细胞和来源于骨髓的树突状细胞，现在人们普遍认为主要是树突状细胞在阴性选择过程中起关键性的作用〔7〕。为了对髓质的基质细胞有更进一步的了解，我们应用噬菌体展示技术来寻找其表面的新分子，以期获得髓质区基质细胞在胸腺细胞发育过程中的影响方面的信息。
材料和方法
噬菌体抗体库：由Utrecht Universtity Hospital的Ton Logtenberg教授惠赠〔8〕。
细菌菌株、辅助噬菌体：E.coli XL1-Blue为抑制型大肠杆菌，用于噬菌体抗体库的扩增。E.coli SF110为非抑制型大肠杆菌，用于生产单链抗体，均由Ton Logtenberg教授惠赠。辅助噬菌体M13K07 购自Gibco/BRL公司。
细胞系：(1) 胸腺树突状细胞系MTDC〔9〕，(2) 胸腺皮质型上皮细胞系TEC1C8〔10〕，(3) 胸腺髓质型上皮细胞系TEC1C6〔10〕、MTEC1〔11〕，(4) 胚胎皮肤树突状细胞系FSDC〔12〕，(5) 脾脏树突状细胞系D2SC〔13〕，(6) 巨噬细胞系RAW264.7〔14〕，所有细胞均培养于含5% CO2的37℃孵箱中，所用培养基为RPMI 1640并辅以10%胎牛血清。
新鲜胸腺细胞、脾细胞的制备：取4周龄BALB/c小鼠处死后取出胸腺、脾，用剪刀剪碎，放在100目的筛网上用PBS缓冲液冲洗胸腺及脾的碎块。收集过滤后成分，1500r/min离心10min，重悬于含10% 胎牛血清的PBS缓冲液中，制成新鲜胸腺细胞和脾细胞悬液。
噬菌体抗体库的富集：初级噬菌体抗体库首先和107的胸腺细胞与脾细胞混合进行预吸收。离心去除细胞后将上清与105 MTDC细胞在室温下孵育2h，然后弃去上清，用含10%胎牛血清的PBS缓冲液振荡洗涤细胞20次以去除非特异结合的噬菌体。最后离心弃去上清，将细胞重悬于200μl 76mmol/L 枸橼酸溶液中，在室温下孵育5min以洗脱结合在细胞上的表达特异抗体的噬菌体。加入800μl 1mol/L的Tris-HCl(pH7.4)缓冲液以中和枸橼酸，5000r/min离心5min，将上清转移至另一无菌Eppendorf管中。将经过筛选的次级噬菌体抗体库和10ml处于对数生长期的大肠杆菌XL1-Blue混合，并在37℃静置30min使表达有特异抗体的噬菌体感染细菌。在37℃剧烈振荡培养30min使被感染的细菌恢复氨苄抗性。加入氨苄青霉素至终浓度为100μg/ml，继续在37℃振荡培养45min。按151的比例加入辅助噬菌体M13K07，在37℃静置30min，使辅助噬菌体感染细菌。感染后继续在37℃振荡培养30min。2800r/min，离心15min，弃去上清。将细菌重悬于25ml含有12μg/ml四环素、100μg/ml氨苄青霉素、25μg/ml卡那霉素的2YT培养基中，在30℃过夜培养。过夜培养物经3000r/min，离心5min去除细菌。将上清转移至一洁净无菌离心管中，加入1/4体积的PEG/NaCl溶液，混匀后在冰水混合物中孵育2h。在4℃以4000r/min离心30min沉淀噬菌体，离心后弃去上清，沉淀重悬于1ml含1% BSA的PBS缓冲液中，经0.45μm的滤膜过滤除菌后进行下一轮富集。此步骤重复4轮。
单链抗体的小量制备：将经4轮富集的抗体库铺到含有氨苄青霉素和四环素的琼脂培养板上，从培养板上挑选单菌落接种到2ml含12μg/ml四环素、100μg/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖的2YT培养基中，过夜培养扩增后提取噬粒(phagemid)。取1μl噬粒转化30μl大肠杆菌SF110，加入500μl SOC培养基在37℃孵育1h以恢复氨苄抗性，取100μl接种到25ml含0.1%葡萄糖及100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于30℃摇床中振荡培养(250r/min)至A(吸光度)=0.5，加入IPTG至其终浓度为1mmol/L，转移至25℃摇床中振荡培养过夜(250r/min)。将过夜培养物以3000r/min离心10min，弃去上清，将沉淀重悬于1/100体积预冷(0℃)的TES(0.2mol/L Tris-HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA pH8.0, 0.5mol/L Sucrose)缓冲液中并转移至Eppendorf管中，混匀后加入1.5/100体积预冷(0℃)的1/4 TES缓冲液，并振荡混匀，放置于冰水中静置1h。将Eppendorf管放置于高速离心机中以14000r/min离心30min，弃掉沉淀，将上清转移至另一无菌Eppendorf管中，冻存于-20℃备用。
免疫组织化学染色分析：将冰冻组织块固定在载物台上，连续切6μm的冰冻切片。切出的切片立即转移至预先用明胶包被的玻片上，并在室温下干燥。干燥后的切片放入丙酮中，在室温下固定5min。固定后的切片放在室温下自然风干。切片干燥后放入PBS/Tween缓冲液中浸泡5min。将解冻的单链抗体加到切片上，和组织切片在室温下孵育30min。用PBS/Tween缓冲液冲洗切片3次，洗去未能和组织结合的单链抗体。加入二抗荧光标记的小鼠单克隆抗体9E10(FITC-9E10)，在室温下黑暗处孵育30min。用PBS/Tween缓冲液冲洗切片3次，洗去未能结合单链抗体的单克隆抗体。用PBS缓冲液冲洗切片1次，最后用滴有抗荧光淬灭剂(Fenyleen diamine)的盖玻片封片，并在荧光显微镜下检查染色类型。
流式细胞计(FACS)染色分析：各种类型的细胞系在培养瓶中生长到合适的密度以后，用PBS冲洗1遍，加入含有0.1%EDTA的PBS并在37℃孵箱中孵育10min使细胞松散。收集细胞，重悬在FACS缓冲液中并调整细胞浓度为2×106/ml。在96孔板中每孔加入105细胞，并加入单链抗体在冰上孵育60min。用FACS缓冲液冲洗细胞2次，加入FITC标记的二抗9E10(FITC-9E10)及碘化丙啶，在冰上孵育30min。用FACS缓冲液冲洗细胞3次，将细胞重悬于100μl FACS缓冲液中。样品的测量在FACScan流式细胞计上进行。
荧光双标记染色：取干燥的冰冻切片放入丙酮中固定，重新浸泡在PBS/Tween缓冲液中。分别在不同的切片上加入大鼠抗小鼠髓质上皮细胞单克隆抗体ER-TR5及仓鼠抗小鼠树突状细胞单克隆抗体N418，在室温下孵育30min。用PBS/Tween缓冲液冲洗切片3次，洗去未结合的游离单克隆抗体。分别加入FITC标记的兔抗大鼠Ig单克隆抗体及FITC标记羊抗仓鼠Ig单克隆抗体，于室温下在黑暗处孵育30min。用PBS/Tween缓冲液冲洗切片3次，洗去未结合的游离荧光抗体。在切片上加入单链抗体，于室温下黑暗处孵育30min。用PBS/Tween缓冲液冲洗切片3次，洗去未结合的游离单链抗体。加入生物素标记的9E10单克隆抗体Bio-9E10，于室温下黑暗处孵育30min。用PBS/Tween缓冲液冲洗切片3次，洗去未结合的游离单克隆抗体。加入Texas Red 偶联的亲和素，于室温下黑暗处孵育30min。用PBS/Tween缓冲液冲洗切片3次，洗去未结合的游离荧光标记亲合素。用PBS缓冲液冲洗切片1次，最后用滴有抗荧光淬灭剂(Fenyleen diamine)的盖玻片封片并在荧光显微镜下检查染色类型。
表1 对MTDC呈阳性的克隆序列
Table 1. Sequences of positive clones specific for MTDC
| Clone number | Amino acid sequence
of CDR3 region |
VH germline
gene family |
VH germline
gene fragment |
VL germline
gene family |
VL germline
gene fragment |
| MTDC4.17 | APHVSYFDY | VH1 | DP-3 | Vκ1 | DP-K9 |
| MTDC4.25 | AHFQFDFDY | VH3 | DP-85 | Vκ1 | DP-K9 |
| MTDC4.29 | APFQFAFDY | VH1 | DP-3 | Vκ1 | DP-K9 |
| MTDC4.31 | DHLWFEFDY | VH3 | DP-32 | Vκ1 | DP-K9 |
| MTDC4.34 | APMLYSFDY | VH1 | DP-3 | Vκ1 | DP-K9 |
| MTDC4.37 | APSSYSFDS | VH1 | DP-3 | Vκ1 | DP-K9 |
| MTDC4.43 | APGRYAFDY | VH1 | DP-3 | Vκ1 | DP-K9 |
| MTDC4.47 | APFQFDFDY | VH1 | DP-3 | Vκ1 | DP-K9 |
| MTDC4.51 | APISYSFDY | VH1 | DP-3 | Vκ1 | DP-K9 |
| MTDC4.53 | APHDYSFDY | VH1 | DP-3 | Vκ1 | DP-K9 |
单链抗体分子序列的测定：利用Sanger双脱氧核苷酸末端终止法，参照Perkin Elmer 荧光测序试剂盒说明进行。重链引物序列为LinkSeq 5′-CGATCCGCCACCGCCAGAG-3′，轻链引物序列为LinkRev 5′-CTCTGGCGGTGGCGGATCG-3′。最后样品在ABI Prism 377自动测序仪上测量。
结果
1．抗体的克隆：从经4轮富集的次级抗体库中我们挑选了60个克隆，制备单链抗体，并用流式细胞计检测它们在细胞系MTDC上的反应性。FACS结果显示所挑到的60个克隆在细胞系MTDC上均呈阳性反应。说明经过4轮富集后，绝大部分克隆为阳性克隆。
2．抗体的序列分析：为了明确这些抗体是来自几个相同的克隆还是分别来自不同的克隆，对这些抗体分别做序列分析。序列分析的结果表明，60个抗体克隆分别来自10个具有不同重链CDR3序列的克隆，而他们的轻链基因则均来自胚系的DK-9基因，结果见表1。
3．抗体特异性检测：为了验证这些抗体克隆结合正常细胞的特异性，利用噬粒转化非抑制型大肠杆菌SF110制备单链抗体，并在冰冻切片上检测其特异性。结果显示，克隆MTDC4.31在冰冻切片上呈阳性反应，能够辨认处于胸腺髓质的基质细胞（见图1）。MTDC4.31在胸腺的皮质无阳性反应。在其他的淋巴组织如脾脏，淋巴结中也呈阴性。
图1 单链抗体MTDC4.31可辨认小鼠胸腺髓质中的基质细胞(×16)
Fig 1. ScFv MTDC4.31 can recognize the stromal cells in mouse thymic medulla(×16)
4．单链抗体MTDC4.31在多种细胞系上的反应性：单链抗体MTDC4.31是通过用胸腺树突状细胞系筛选抗体库而得到的。结合其在冰冻切片上的反应性，我们选取了几株其它相关的细胞系来确认被此抗体辨认的抗原所分布的细胞类型。FACS数据表明，MTDC4.31除了在树突状细胞系MTDC4上呈阳性反应外，在树突状细胞系D2SC及FSDC中呈微弱的阳性反应，在髓质型上皮细胞系MTEC1，TEC1C6中也呈明显的阳性反应。而在其它所检查的皮质型上皮细胞系TEC1C8及巨噬细胞系RAW264.7中均呈阴性反应（见图2）。
图2 单链抗体MTDC4.31 在各种细胞系上的反应性
Fig 2.Reactivity of ScFv MTDC4.31 on various cell lines
5．单链抗体MTDC4.31的荧光双标记染色：根据以上染色结果及FACS数据表明抗体MTDC4.31所辨认的抗原主要分布在胸腺的髓质，且在树突状细胞及髓质上皮细胞表面均有表达。为进一步确认其在正常胸腺基质中分布的细胞类型，我们用荧光标记的方法探查了此抗体分别和树突状细胞特异抗体N418及胸腺髓质上皮细胞特异抗体ER-TR5共标记的情况。如图3所示，在用髓质上皮细胞特异抗体ER-TR5的双标记染色中，在胸腺的髓质有些细胞只被抗体ER-TR5标记(绿色)，有些细胞只被抗体MTDC4.31标记(红色)，还有些细胞可被两种抗体同时标记(橙色)。通过计数可看到，(60～70)%的ER-TR5+细胞可被MTDC4.31标记。同样在用树突状细胞特异抗体N418进行双标记时，也可以发现同时标有两种颜色的细胞(图4)，但此种细胞的数量非常少。只有20%的N418+细胞能被MTDC4.31标记。其它大部分细胞只能被一种抗体标记。
图3 单链抗体MTDC4.31 与单克隆抗体ER-TR5的荧光双标记染色(×100)
Fig 3. Double labeling staining of ScFv MTDC4.31 and McAb ER-TR5(×100)
图4 单链抗体MTDC4.31 与单克隆抗体N418的荧光双标记染色(×100)
Fig 4. Double labeling staining of ScFv MTDC4.31 and McAb N418(×100)
讨论
本实验利用来源于小鼠胸腺的树突状细胞系MTDC对一个半合成的噬菌体抗体库进行了4轮筛选。并从经4轮筛选后得到的次级抗体库中得到了多株对细胞系MTDC特异的单链抗体。从挑选到的克隆的阳性率上看，经4轮筛选后阳性克隆的富集程度是相当高的，100%均为阳性，这些抗体在序列上有很强的相似性，在主要决定抗体特异性的CDR3区的氨基酸序列通常只有几个氨基酸不同。
在所挑选的这些抗体中，并不是所有对细胞系阳性的抗体对正常的细胞也呈阳性反应，说明培养的细胞可能表达了一些正常细胞不表达的抗原。在所挑到的抗体中，有一个抗体MTDC4.31对胸腺髓质的正常细胞仍然呈阳性反应，荧光双标染色实验表明，此抗体辨认的抗原同时表达在髓质的上皮细胞及树突状细胞表面。
根据我们所得双标记实验结果，可以把胸腺髓质内的基质细胞进行更精细的分类，分成更多的亚型。在树突状细胞中存在两种细胞，一种表达MTDC4.31所识别的抗原，另一种不表达。同样，在髓质上皮细胞中也存在着MTDC4.31+及MTDC4.31-两种亚群。由于N418及ER-TR5分别为树突状细胞及髓质上皮细胞的通用标记〔15，16〕，MTDC4.31的发现为此两类细胞亚群的存在提供了依据。
胸腺微环境是一个非常复杂的系统，里面的各种组分均有其独特的功能。同时各种组分之间又有许多相同的成分。例如胸腺的皮质上皮细胞和胸腺树突状细胞共表达能够被单克隆抗体NLDC145辨认的DEC-205受体〔17〕，提示在胸腺上皮细胞和树突状细胞之间存在着某种联系。但到目前为止，还没有可同时辨认胸腺髓质上皮细胞和树突状细胞的单克隆抗体出现。单链抗体MTDC4.31能够辨认共表达在胸腺髓质上皮细胞亚群和胸腺树突状细胞亚群上的抗原，提示在胸腺髓质上皮细胞和胸腺的树突状细胞之间也可能存在着某种联系。同时在RelB-/-基因缺陷鼠的胸腺中，绝大部分髓质的上皮细胞和树突状细胞同时消失〔18〕，说明这两种细胞的发育进程相互联系。虽然现在还不清楚这种联系的原因，但MTDC4.31的发现为证实这种联系提供了线索。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39707410)；荷兰KNAW基金资助项目
参考文献
1，Metcalf D. In “The Thymus” (D. Metcalf, Ed.). Springer-Verlag, New York, 1966, Vol.5, p.1.
2，Boyd RL, Tucek CL, Godfrey DI, et al. The thymic microenvironment. Immunol Today, 1993, 14:445-459.
3，Wilkinson RW, Anderson G, Owen JJ, et al. Positive selection of thymocytes involves sustained interactions with the thymic microenvironment. J Immunol, 1995, 155:5234-5240.4，Scollay R, Godfrey DI. Thymic emigration: conveyor belts or lucky dipsImmunol Today, 1995, 16:268-273.
5，Lu LS, Chen WF. Functional maturation of mouse CD4+CD8- thymocytes induced by medullary type thymus epithelial cells. Sci China (C Life Sci), 1996, 39:427-439.
6，Sprent J, Lo D, Gao EK, et al. T cell selection in the thymus. Immunol Rev, 1988, 101:173-190.
7，Marrack P, Lo D, Brinster R, et al. The effect of thymus environment on T cell development and tolerance. Cell, 1988, 53:627-634.
8，de Kruif J, Boel E, Logtenberg T. Selection and application of human single chain Fv antibody fragments from a semi-synthetic phage antibody display library with designed CDR3 regions. J Mol Biol , 1995, 248:97-105.
9， Shu SZ, Chen WF, Liu ZG, et al. Establishment and identificaiton of epithelial mouse thymic stromal cell lines. J Beij Med Univ,1993, 25:237-241.
10，Mizuochi T, Kasai M, Kokuho T, et al. Medullary but not cortical thymic epithelial cells present soluble antigens to helper T cells. J Exp Med, 1992, 175:1601-1605.
11，Chen WF, Fan W, Cao LX, et al. Multiple types of cytokines constitutively produced by an established murine thymic epithelial cell line. Eur Cytokine Netw, 1992, 3:43-52.
12，Girolomoni G, Lutz MB, Pastore S, et al. Establishment of a cell line with features of early dendritic cell precursors from fetal mouse skin. Eur J Immunol, 1995, 25:2163-2169.
13，Granucci F, Girolomoni G, Lutz MB, et al. Modulation of cytokine expression in mouse dendritic cell clones. Eur J Immunol, 1994, 24:2522-2526.
14，Ralph P, Nakoinz I. Antibody-dependent killing of erythrocyte and tumor targets by macrophage-related cell line: enhancement by PPD and LPS. J Immunol, 1977, 119:950-954.
15，Metlay JP, Witmer-Pack MD, Agger R, et al. The distinct leukocyte integrins of mouse spleen dendritic cells as identified with new hamster monoclonal antibodies. J Exp Med, 1990, 171:1753-1771.
16，Van Vliet E, Melis M, van Ewijk W. Monoclonal antibodies to stromal cell types of the mouse thymus. Eur J Immunol, 1984, 14:524-529.
17，Inaba K, Swiggard WJ, Inaba M, et al. Tissue distribution of the DEC-205 protein that is detected by the monoclonal antibody NLDC-145. I. Expression on dendritic cells and other subsets of mouse leukocytes. Cell Immunol, 1995, 163:148-156.
18，Naspetti M, Aurrand-Lions M, DeKoning J, et al. Thymocytes and RelB-dependent medullary epithelial cells provide growth-promoting and organization signals, respectively, to thymic medullary stromal cells. Eur J Immunol, 1997, 27:1392-1397.
(收稿日期：1999-06-04)