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肺炎克雷伯菌的耐药性及PFGE电泳核型
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 细菌学
作者：胡冬梅 陈世平
单位：胡冬梅（解放军海军总医院检验科）；陈世平（感染管理研究科）
关键词：肺炎克雷伯菌；医院感染；超广谱β-内酰胺酶；脉冲场凝胶电泳
【 摘要 】 目的 探讨肺炎克雷伯菌耐药表型和基因组型之间的关系。 方法 以双纸片协同试验(DDST)筛选出产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌(ESBL-KP)；用XbaⅠ酶对各试验菌株进行限制性酶切，脉冲场凝胶电泳（PFGE）分离酶切片段。 结果 PFGE很好地显示出了种内菌株间的多态性；ESBL-KP之间基因组型多态性较各敏感株之间明显，未发现特异性ESBL基因条带。 结论 ESBL-KP之PFGE核型与各敏感株相比有明显的多态性；PFGE不能定位ESBL基因。
Drug resistance and the PFGE electrophoretic karyotype of Klebsiella pneumoniae
HU Dongmei, CHEN Shiping
（Laboratory Department of Chinese PLA Navy General Hospital, Beijing 100037, P.R.China）
【 Abstract 】 Objective Study the relationship of genome type with drug resistance of Klebsiella pneumoniae. Methods The extended spectrum β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae (ESBL-KP) spp. were screened out by the double disc synergy test (DDST); all the strains were digested by XbaⅠ, and the fragments were isolated by pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Results The polymorphism of all the strains tested were well pictured by PFGE; the genomic polymorphism of the ESBL-KP is more apparent than the sensitive strains, but the specific ESBL gene fragments were not found on the gel. Conclusion The genomic polymorphism of the ESBL-KP shown by PFGE is more apparent than that of sensitive strains; PFGE can not be used for positioning of ESBL genes.
【 Subject words 】 Klebsiella pneumoniae; Nosocomial infection; Extended spectrum β-lactamases; Pulsed field gel electrophoresis
肺炎克雷伯菌是医院和社区感染的重要病原菌。近年来其对抗生素的耐药性不断增强，最显著的是它能产生大量的超广谱β-内酰胺酶（ESBLs），对第三代头孢菌素产生耐药性。由这些产ESBL肺炎克雷伯菌(ESBL-KP)引起的医院感染有时很难治疗，已引起人们的重视。我们以脉冲场凝胶电泳（PFGE）获得肺炎克雷伯菌株的电泳核型，并对其耐药表型与基因组型的关系进行了分析。
材料与方法
菌株：从解放军总医院微生物科收集并经常规鉴定的肺炎克雷伯菌临床分离株18株、催产克雷伯菌临床分离株1株和肺炎克雷伯菌标准株ATCC27736(A2)，见表1。
试剂：溶菌酶、蛋白酶K、XbaⅠ酶等均购自宝泰克公司，抗生素纸片、MH培养基均购自北京天坛药品生物技术开发公司。
表1 克雷伯菌分离株临床资料
Table 1. Clinical data of the Klebsiella spp
| No. of
strains |
Sex/Age | Specimens | Clinical diagnosis |
| 1 | M/44 | Sp | Chronic renal insufficiency |
| 2 | F/67 | Sp | Bronchial asthma |
| 3 | M/59 | Sp | Postoperation of cardiac cancer |
| 4 | M/83 | Sp | Chronic bronchitis for acute attack |
| 5 | M/80 | Sp | Upper respiratory tract infection |
| 6 | M/60 | Sp | Throat mucus |
| 7 | M/70 | As | Tumor of biliary duct |
| 8 | F/72 | Ur | Urinary infection |
| 9 | M/41 | Se | Duodenectomy |
| 10 | M/38 | Sp | Tumor of duodenum |
| 11 | F/70 | Ur | Urinary infection |
| 12 | M/65 | Sp | Pneumonitis |
| 13 | F/47 | Bl | Endocarditis |
| 14 | M/70 | Ur | Urinary infection |
| 15 | M/45 | Dr | Liver abscess |
| 16 | M/78 | As | Tumor of biliary duce |
| 17 | F/54 | Se | Duodenectomy |
| 18 | M/73 | Sp | Cancer of lung |
| 19 | F/68 | Ur | Urinary infection |
Sp: sputum, As: ascites, Ur: urine, Bl: blood, Dr: drain, Se: secrete
细胞悬浮液：10mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA(pH8.0)，1mol/L NaCl；裂解缓冲液：10mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)，100mmol/L EDTA(pH8.0)，1mol/L NaCl，0.2%脱氧胆酸钠，0.5%十二烷肌氨酸；蛋白裂解液：250mmol/L EDTA(pH8.0)，10mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，1%十二烷肌氨酸。
常规药敏试验(AST)：以13种抗生素纸片，分别是青霉素类，第一、二、三代头孢菌素类，喹诺酮类，氨基糖苷类及磺胺类的代表药物，作常规药敏试验，质控菌株为E.coli ATCC 25922。
双纸片协同试验（DDST）：实验方法同常规药敏试验，选出对一种或一种以上第三代头孢菌素耐药的菌株，将奥格门汀(Aug)纸片置于平皿中央，头孢哌酮(CFP)、头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、头孢三嗪(CRO)纸片分别与Aug间隔30mm放置，孵育20h后观察协同作用。
脉冲场凝胶电泳（PFGE）：将培养过夜之菌悬液离心洗涤，以(4±1)×109 CFU/ml浓度制成琼脂糖胶块。分别用溶菌酶和蛋白酶K裂解处理后，以XbaⅠ酶于37℃酶切18h，然后将胶块洗涤，上样，于14℃在GenePathTM电泳仪中以“Enb”程序(肠杆菌科程序)进行电泳。电泳完成后，EB染色，紫外仪下拍照。
统计处理：对PFGE电泳图谱进行数值分类，根据marker算出各条带的相对迁移率，转化成数据，以数值分类软件进行处理。
结果
1.AST结果：药敏试验结果判定标准参照1999年版NCCLS，见表2。
2.DDST结果：任一种第三代头孢菌素的抑菌环变小(同敏感菌相比)，并且与Aug纸片之间的抑菌区扩大(协同作用)，即认为是存在着ESBLs，为DDST阳性结果〔1〕，见表3。依此标准，由DDST筛选出的阳性株有7、8、11、13、14、15、16、17、18、19，约占56％。
3.PFGE结果：以XbaⅠ对肺炎克雷伯菌和催产克雷伯菌染色体DNA进行酶切后可产生8～22条DNA片段，片段范围约30～650kb(见图1～3)。
4.统计结果：将PFGE带型资料转化成数值资料后，计算出各菌株之间的相似性系数(Similarity coefficient, Ssm)，根据Ssm进行单链锁聚类分析，得到相似性系数三角矩阵及聚类分析树状谱(见图4、5)。以Ssm为标准(该菌与其余各菌株之相似性系数的最大值不小于该组的相似性系数值)，可将肺炎克雷伯菌各菌株分为三组：Ⅰ：6、2、1、5、4、18（Ssm=42.1%）；Ⅱ：15、17、11、8、7、16、10(Ssm=38.4%)；Ⅲ：3、13、19、12、14(Ssm=33.3%)。
表2 常规药敏试验结果
Table 2. AST results of Klebsiella spp
| Strain | PIP | CZ | CF | CXM | CFP | CAZ | CTX | AM/
IU |
GM | AN | NOR | CIP | SMZ |
| 1 | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S |
| 2 | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S |
| 3 | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S |
| 4 | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S |
| 5 | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S |
| 6 | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S | S |
| 7 | R | R | R | R | R | R | R | I | S | S | S | S | R |
| 8 | R | R | R | R | R | R | R | R | S | S | I | I | S |
| 9 | R | R | R | R | S | S | I | R | R | S | S | I | R |
| 10 | I | R | R | I | I | I | I | S | S | S | S | S | S |
| 11 | R | R | R | R | R | R | R | R | R | R | I | I | R |
| 12 | R | R | R | R | I | S | S | R | R | S | R | R | R |
| 13 | R | R | R | R | R | I | R | R | S | S | S | S | S |
| 14 | R | R | R | R | I | S | I | R | R | S | R | R | R |
| 15 | R | R | R | R | R | I | R | R | R | S | S | S | R |
| 16 | R | R | R | I | I | R | I | I | S | S | S | S | S |
| 17 | R | R | R | R | R | S | I | R | R | S | S | S | R |
| 18 | I | R | R | R | R | I | I | I | R | S | S | S | R |
| 19 | R | R | R | R | R | I | R | R | R | R | S | S | S |
PIP：piperacillin, CZ: cefazolin, CF: cephaolothin, CXM: cefuroxime, CFP: cefoperazone, CAZ: ceftazidime, CTX: cefotaxime, AM/IU: Unasyn, GM: gentamicin, AN: amikacin, NOR: norfloxacin, CIP: ciperafloxin, SMZ: sulfonamides
S：sensitive, R: resistant, I: intermediate
表3 DDST试验结果(抑菌环直径，mm)
Table 3. DDST results of ESBL-KP spp
| Strain | Aug | CFP | CAZ | CTX | CRO |
| 7 |
15.0(I) |
18.46(S) |
13.0(R) |
15.0(I) |
15.0(I) |
| 8 | 11.26(R) | 8.2(R) | 16.5(I) | 9.0(R) | 7.26(R) |
| 11 | 13.7(R) | 10.8(R) | 19.4(S) | 12.5(R) | 11.0(R) |
| 13 | 16.0(I) | 6.0(R) | 20.0(S) | 6.0(R) | 6.0(R) |
| 14 | 22.0(S) | 15.0(I) | 25.0(S) | 6.0(R) | 12.0(R) |
| 15 | 13.0(R) | 10.0(R) | 20.0(S) | 6.0(R) | 6.0(R) |
| 16 | 18.0(S) | 16.0(I) | 12.0(R) | 15.0(I) | 16.0(I) |
| 17 | 14.0(R) | 8.0(R) | 22.0(S) | 6.0(R) | 10.0(R) |
| 18 | 13.2(R) | 14.0(R) | 18.0(S) | 6.0(R) | 17.0(I) |
| 19 | 16.0(I) | 8.0(R) | 21.0(S) | 6.0(R) | 6.0(R) |
R: resistant, I: intermediate, S: sensitive
讨论
1983年第一次在德国发现了耐广谱头孢菌素的肺炎克雷伯菌临床分离株〔2〕，1985年首次报道了由ESBL-KP引起的医院感染〔3〕。ESBLs 是由原来的TEM-1、TEM-2和SHV-1型酶发生点突变产生的，可水解广谱β-内酰胺类制剂而对第三代头孢菌素耐药，其数量很大，在世界各地都有发生〔4〕。ESBLs在肠杆菌科的肺炎克雷伯菌中发生率最高，克雷伯菌属没有可被头孢菌素诱导或抑制的基因，野生株在选择出菌毛缺失株或获得质粒介导的β-内酰胺酶基因的情况下即可获得对第三代头孢菌素的耐药性〔5〕。美国有资料显示，ICU中肺炎克雷伯菌对头孢他啶的耐药率已达14.4%〔6〕；国内报道不一，据最近的资料，ESBL-KP发生率已达25.8%〔7〕，是相当高的。流行病学研究表明，ESBLs感染暴发可由单一ESBL基因(存在于染色体、质粒或转座子上)传播和ESBL菌株的水平传播而引起。同一种新进化的ESBL可在不同时间、不同地点发生，同一菌株有时也可带有多种ESBLs。带有ESBL基因的质粒也常带有耐氨基糖苷基因、耐TMP-SMZ基因、耐喹诺酮基因等，这就使ESBL-KP引起的感染很难治疗。住院时间长的患者其胃肠道有明显的肺炎克雷伯菌定植，而医院内广泛应用最先进的抗菌素和某些宿主因素可减少肠道正常菌群，降低肠道的“定植抵抗力”，从而使得患者肺炎克雷伯菌定植率增加，患者获得感染的危险性增加。
图1 肺炎克雷伯菌敏感株PFGE图谱
Fig 1. PFGE results of sensitive Klebsiella spp
图2 克雷伯菌属产ESBL耐药型菌株PFGE图谱
Fig 2. PFGE results of resistant and ESBL-producing Klebsiella spp
图3 产ESBL肺炎克雷伯菌株PFGE图谱
Fig 3. PFGE results of ESBL-KP spp
图4 克雷伯菌PFGE分析相似性三角矩阵(%)
Fig 4. Pairwise of similarity coefficient from Klebsiella spp, produced by PFGE
图5 克雷伯菌PFGE分析聚类结果树状谱
Fig 5. Dendrogram of PFGE results of Klebsiella spp
由PFGE聚类结果可以看出，大体上是敏感菌聚在一群，耐药菌聚在一群，而每一群又都有例外，并不是相互排斥的关系。耐药株之间的Ssm范围是40％～0％，未发现某个或某几个条带为几株ESBL-KP所特有；敏感株之间的Ssm范围是45.1％～13.3％；敏感株与耐药株之间Ssm范围是38.4％～6.6％。总体上耐药株之间的Ssm低于敏感菌株之间的Ssm，呈现出更明显的多态性。
耐药菌是由敏感菌株变异而来，变异机制有多种，但最重要的是基因突变。不论是小的基因插入、缺失，或是大的基因重排，都会导致限制性内切酶酶切位点的增加、丢失或相对的空间位移，使酶切片段长度改变，改变了的DNA片段在凝胶中的迁移率相应变化，反映在PFGE电泳图谱上就是带型的改变，表现出其多态性的特征。PFGE是以限制性内切酶对染色体DNA酶切后所得的基因片段系列为分析依据的。染色体基因组突变、肺炎克雷伯菌ESBL基因多型性、ESBL-KP带有其它耐药基因等因素都可能影响最后的电泳结果，呈现出ESBL-KP基因组型的多态性。实验所采集的各临床菌株并非医院感染暴发性相关菌株，但即使在医院感染暴发期间所分离的肺炎克雷伯菌克隆株也会有微小的基因组差异，这种差异反映了医院环境中致病性细菌基因组的易变性〔8〕。所以，PFGE技术不能定位ESBL基因。
参考文献
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(收稿日期：1999-06-16)