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固相PF18-3单抗促进亚适量Con A诱导的胸腺细胞活化后凋亡
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第5期第20卷 基础免疫学
作者：肖士云 陈慰峰
单位：肖士云（北京大学医学部免疫系 卫生部医学免疫学重点实验室）（江西省赣南医学院免疫学教研室）；陈慰峰（北京大学医学部免疫系 卫生部医学免疫学重点实验室）
关键词：胸腺细胞；单克隆抗体；细胞凋亡
【 摘要 】 目的 研究PF18-3单抗识别分子和胸腺细胞活化及凋亡的关系。 方法 应用3H-TdR掺入实验及流式细胞术(FACS)技术，分析了胸腺细胞与固相单抗PF18-3共育后细胞活化过程中3H-TdR掺入、细胞周期及DNA亚二倍体变化、早期活化及凋亡分子的表达。 结果 固相单抗PF18-3有弱的促胸腺细胞3H-TdR掺入和促进CD25的表达，当有亚适量Con A存在时作用更明显。与对照组相比，PF18-3及亚适量Con A共育后，24、48h时活细胞数量减少。细胞周期分析，G0/G1期细胞相对减少，S期相对增多，但G2/M期无明显变化。凋亡相关分析，共育后24、48h时DNA亚二倍体阳性细胞及12h时AnnexinV结合阳性细胞增多。 结论 PF18-3单抗识别分子能协同亚适量Con A对胸腺细胞的活化，并诱导胸腺细胞活化后凋亡。
Enhancement of sub-optimal doses of Con A-mediated activation and apoptosis of thymocytes by immobilized PF18-3 McAb
XIAO Shiyun, CHEN Weifeng.
（Department of Immunology, Peking University Health Science Center, Beijing 100083, P. R. China）
【 Abstract 】 Objective To investigate the relationship between PF18-3 McAb recognized molecule and thymocyte activation induced apoptosis. Methods Use 3 H-TdR uptake test and FACS technique to analyze 3 H-TdR uptake, cell cycle, DNA hypodiploid and expression of early activation or apoptosis molecule. Results Immobilized PF18-3 McAb increased 3 H-TdR uptake and CD25 expression on thymocytes when costimulated with sub-optimal doses of Con A. However, in contrast to control group, the number of viable cells decreased. Cell cycle analysis in thymocyte cultures showed that the proportion of cells at G0/G1 phase decreased, cells at S phase increased relatively, but no obvious change at G2/M phase. Apoptosis connected analysis showed that both DNA hypodiploid cell (at 24-48h) and AnnexinV binding positive cells (at 72h) increased. Conclusion The molecule recognized by PF18-3 McAb enhanced sub-optimal doses of Con A to induce activation of thymocytes and early cell death by apoptosis.
【 Subject words 】 Thymocyte; Monoclonal antibody; Apoptosis
T细胞活化后有两种不同结果：一是T细胞的完全活化，导致T细胞的增殖并发挥功能效应；另一种是不完全活化，T细胞进入无能状态或凋亡〔1〕。两种不同的活化结果，取决于T细胞活化所需的两种必须信号：即特异性TCR与APC提呈的MHC-Ag多肽复合物的相互作用和由APC提呈的共刺激信号〔2〕。CD28/CD80、CD86是已知最重要的共刺激信号分子，除此之外，CD2、CD5、CD9、CD26、CD43、CD44、CD47、CD69、Ia、LFA-1/ICAM-1〔3-5〕等分子均有报道称其具有共刺激分子作用，但它们的作用机理仍然不很清楚。我们曾报道，从大鼠抗小鼠胸腺基质细胞单抗中筛选得到系列抗体，其中PF18-3单抗识别分子共表达于胸腺基质细胞(TSC)和活化胸腺细胞〔6〕。而PF18-3单抗具有抑制小鼠胸腺上皮细胞系-MTEC1对胸腺细胞的促增殖以及小鼠胸腺树突状细胞系-MTDC对胸腺细胞的促凋亡作用〔7,8〕。本研究进一步发现，固相PF18-3单抗具有协同亚适量Con A对胸腺细胞的活化，并促进胸腺细胞活化后凋亡。
材料与方法
动物：4～6周龄BALB/c雌性小鼠（北京大学医学部实验动物部提供）。
试剂：PF18-3单抗腹水（本室制备），FITC-抗CD25（BD公司），PI、Con A(Sigma)，3H-TdR(上海原子核研究所)，AnnexinV检测试剂盒（Pharmangen）。
培养基及溶液：pH 7.4 PBS溶液，用于单抗包被。平衡缓冲液(BSS) +2％NCS用于洗涤细胞，1.090淋巴细胞分层液，RPMI 1640 +10％NCS用于细胞培养。FACS保存液（2％葡萄糖+0.1％叠氮钠+1%甲醛PBS）。闪烁液（Wallac公司）。
PF18-3单抗包被于96或24孔培养板：PF18-3单抗腹水，用pH 7.4 PBS按倍比稀释，不同稀释度包被于96或24孔平底培养板，分别加100或400μl/孔。4℃过夜或37℃ 2h。无血清PBS洗3遍备用。
3 H-TdR掺入实验：新鲜胸腺细胞106/孔接种于已包被PF18-3抗体（1∶100稀释的腹水）的96孔平底板，在不同剂量的Con A浓度条件下，RPMI 1640培养基中孵育72h。于结束孵育前12h掺入3H-TdR 18.5kBq（0.5μCi）/孔。收获细胞，液闪仪(Wallac公司)测cpm值。
FACS分析
细胞周期动态分析：新鲜胸腺细胞4×106/孔接种于已包被PF18-3的24孔培养板，按要求加Con A。于24、48、72h收获不同条件下共育细胞，Ficoll分层液取活细胞，调成106/管，无血清PBS洗1遍，RNA酶处理，保存于1ml PBS液中，上机前加 Triton+PI 1滴，立即检测。Cellfit Cellcycle analysis软件拟合统计G0/G1、S、G2/M各期细胞比例。
DNA亚二倍体分析：细胞制备同细胞周期分析，上机检测后，LysisⅡ软件进行分析。
共育后细胞表型分析：收获共育后细胞，用BSS +2％NCS洗涤1遍，调细胞成107/ml，每管100μl，加FITC-抗CD25，4℃孵育40min，BSS +2％NCS洗涤1遍，加FACS保存液，FACS检测。
AnnexinV结合检测：按试剂盒说明，主要步骤：收获共育后细胞，用无血清PBS洗涤2遍，用结合缓冲液调细胞成106/ml，每管100μl。加FITC-AnnexinV 5μl和PI 2μl，室温暗处反应15min，每管补加400μl结合缓冲液，1h内FACS检测。
结果
1.固相PF18-3单抗协同亚适量Con A促进胸腺细胞3H-TdR掺入：新鲜分离的胸腺细胞，在有或无Con A存在下，与固相PF18-3单抗共同培养72h，检测3H-TdR掺入的cpm值。结果在无Con A存在时，固相PF18-3单抗有弱的促胸腺细胞3H-TdR掺入作用，并呈剂量依赖关系。PF18-3单抗能明显的协同Con A促进胸腺细胞3H-TdR的掺入，其协同效应以Con A终浓度0.75mg/ml 的亚适量时更为明显，见表1。
表1 固相PF18-3单抗共刺激促进亚适量Con A诱导的胸腺细胞3H-TdR掺入
Table 1. Effects of the costimulation of immobilized PF18-3 McAb on 3 H-TdR incorporation of thymocytes activated by suboptimal doses of Con A
| Thymocyte
plus |
Antibody
dilution |
3 H-TdR incorporation(cpm) | |
| Con A 0(mg/ml) | Con A 0.75(mg/ml) | ||
| Medium |
658± 23 |
3632±280 |
|
| PF18-3 McAb |
1∶25 |
2454± 21* | 9664±608* |
| 1∶100 | 2180±210* | 7430±704* | |
| 1∶400 | 1730± 56 | 4156±232 | |
| 1∶1600 | 834± 32 | 3287±204 | |
| *：P＜0.05 as compared with negative group 2.固相PF18-3单抗促进T细胞活化分子CD25的表达：在不同剂量的Con A存在下，分析新鲜分离的胸腺细胞与固相PF18-3单抗（1∶100稀释腹水）共育后12～48h，CD25的表达动态变化结果表明：单纯固相PF18-3单抗和亚适量Con A均可诱导胸腺细胞CD25的表达，随共育时间的增加表达增多，而两者共刺激有明显的协同效应，但仍不如适量Con A（3.0mg/ml）的作用，见图1。 |
| 图1 固相PF18-3单抗及亚适量Con A共刺激促进胸腺细胞CD25的表达
Fig 1. Expression of CD25 in thymocytes induced by costi mulation of immobilized PF18-3 McAb and sub-optimal doses of Con A A: Medium; B: Sub-Con A (Sub-optimal dose of Con A); C: Con A; D: Rat-Ig; E: PF18-3 McAb; F: PF18-3 McAb+Sub-Con A 3.共育后活细胞计数：新鲜胸腺细胞与固相PF18-3单抗及不同剂量Con A共育，24～72h分别收获细胞，伊红染色活细胞计数结果与对照组相比，24～48h实验各组活细胞数量明显减少，72h活细胞数却相对增多，见图2。 |
图2 胸腺细胞共刺激培养后活细胞计数
Fig 2. Viable cell counter of thymocytes following costimulation culture
表2 胸腺细胞共刺激培养后细胞周期分析
Table 2. Cell cycle analysis of thymocytes following costimulation
| Thymocyte plus | 24 h | 48 h | 72 h | ||||||
| G0/G1 | S | G2/M | G0/G1 | S | G2/M | G0/G1 | S | G2/M | |
| Medium |
92.5 |
1.1 |
6.4 |
88.7 |
5.7 |
5.6 |
86.4 |
5.2 |
8.7 |
| PF18-3 McAb | 90.2 | 1.0 | 8.8 | 80.3 | 13.3* | 6.4 | 81.2 | 12.7* | 6.1 |
| Sub-Con A | 89.2 | 1.8 | 9.1 | 74.4 | 16.2* | 9.4 | 56.2 | 36.4** | 7.4 |
| Sub-Con A+PF18-3 McAba | 88.6 | 1.1 | 10.3 | 72.2 | 20.2* | 7.6 | 45.8 | 48.4** | 5.8 |
| Con A | 81.3 | 4.2 | 14.5 | 76.3 | 11.8* | 11.9 | 77.4 | 12.5* | 10.1 |
| Rat-Ig | 91.6 | 1.2 | 7.2 | 87.3 | 6.1 | 6.6 | 84.8 | 6.7 | 9.5 |
a: Sub-optimal dose of Con A；*P＜0.05，**P＜0.01 as compared with negative 4.固相PF18-3单抗对细胞周期的影响：新鲜分离的胸腺细胞和不同剂量Con A及PF18-3共育后，分层液去死细胞，不同时间PI染色，FACS分析细胞周期的变化。结果表明：共育后24～72h，与阴性对照组相比，单纯PF18-3单抗及亚适量Con A组G0/G1细胞明显减少，S期细胞明显增多，而G2/M期细胞基本不变。PF18-3单抗与亚适量Con A具有协同促进共育细胞由G0/G1期向S期细胞的转变，但G2/M期细胞并不增多。而阳性对照组（适量Con A 3.0mg/ml）尽管24h G0/G1期减少，但48～72h G0/G1期细胞维持约75%左右，且S期及G2/M期细胞均同时增多，各期细胞数量保持一定比例关系。可见单纯PF18-3单抗或/和亚适量Con A只能诱导胸腺细胞的活化，但未能促进细胞的增殖，见表2。
5.固相PF18-3单抗促进胸腺细胞凋亡
（1）DNA亚二倍体：新鲜分离的胸腺细胞和不同剂量Con A及PF18-3共育后不同时间PI染色，FACS分析细胞DNA亚二倍体。与阴性对照组相比，共育12h后实验各组DNA亚二倍体细胞明显增多，并于48h达80％阳性高峰，而对照组此时为65％，至72h才达约80％。可见亚适量Con A及PF18-3均可促进亚二倍体阳性细胞形成，两者共刺激时效果更明显。而阳性对照组（适量Con A）于48h达高峰后，亚二倍体阳性细胞不再增加而相对减少，见表3。
表3 胸腺细胞共刺激培养后DNA亚二倍体分析
Table 3. Analysis of DNA hypodiploid in thymocytes following costimulation
| Thymocytes
plus |
Proportion of hypodiploid cell in each group (%) | |||
| 12 h | 24 h | 48 h | 72 h | |
| Medium |
20.1 |
52 |
69 |
88 |
| Con A | 35.6 | 75* | 80* | 76 |
| Sub-Con Aa | 28.0 | 68 | 83* | 87 |
| PF18-3 McAb | 27.4 | 62 | 81* | 87 |
| PF18-3 McAb +Con A |
33.6 | 70* | 86* | 89 |
| Rat-Ig | 22.5 | 50.4 | 65 | 85 |
a: Sub-optimal dose of Con A；*P＜0.05 as compared with negative （2）AnnexinV结合检测：应用AnnexinV检测试剂盒，分析新鲜分离的胸腺细胞和Con A及PF18-3共育后早期凋亡的细胞。结果表明：于12h时PF18-3单抗及亚适量Con A组AnnexinV结合阳性细胞明显增多，对照组由28％提高到40％和41%。两者共刺激时为51％，见图3。
图3 胸腺细胞共刺激培养后AnnexinV结合检测
Fig 3. AnnexinV binding assay of thymocytes following costimulation
A: Medium; B: Sub-Con A (Sub-optimal dose of Con A); C: Con A; D: Rat-Ig; E: PF18-3 McAb; F: PF18-3 McAb+Sub-Con A
讨论
我们的实验表明，固相PF18-3单抗具有一定增加胸腺细胞的3H-TdR掺入作用，但其作用很弱，不如Con A或抗CD3/TCR抗体（结果未显示）。我们起初考虑该作用可能由于：一是促进胸腺细胞的活化；二是维持了细胞的存活。而单从3H-TdR掺入似乎更可能为后者，因为3H-TdR掺入值不高。然而我们以前的实验表明，PF18-3分子可表达于Con A活化的胸腺细胞，且PF18-3单抗具有抑制MTEC1促胸腺细胞的增殖作用〔8〕。因此我们认为，PF18-3分子更可能与胸腺细胞活化相关，具有辅佐胸腺细胞活化作用。固相PF18-3单抗促进亚适量的Con A对胸腺细胞的3H-TdR掺入及CD25的表达，表明PF18-3单抗促进了亚适量Con A胸腺细胞活化，进一步证明PF18-3分子为胸腺细胞活化的辅佐分子。
然而，在以上实验中，我们监测共育后存活细胞数发现，与对照组相比，尽管实验组3H-TdR掺入值高于阴性对照组，但24～48h存活细胞数却并不增加，而且比对照组还低，提示其活化作用导致了细胞的死亡。为此，我们分析了活化过程中细胞周期的变化，与对照组相比，不同时期固相PF18-3单抗实验组G0/G1期细胞相对减少，S期明显相对增多，而G2/M期细胞数基本不变。且固相PF18-3单抗有明显协同亚适量Con A的促G0/G1期细胞向S期细胞转变，但G2/M期细胞也不增多，与适量Con A作用不同（刺激后，S期和G2/M期同时增加）。可见亚适量Con A或/和固相PF18-3均只能诱导静止期细胞进入DNA复制和蛋白质合成期（S期），却不能最终使细胞进入分裂期（G2/M期）。说明固相PF18-3单抗与亚适量Con A以及两者的共刺激导致的胸腺细胞的活化是不完全的活化作用。
我们知道，T细胞活化后有两种不同结果：一是T细胞的完全活化，导致T细胞的增殖并发挥功能效应；另一种是不完全活化，T细胞进入无能状态或凋亡。是否固相PF18-3单抗与亚适量Con A以及两者的共刺激导致了胸腺细胞的凋亡？进一步的凋亡相关性分析表明，于共刺激培养12～48h，亚二倍体阳性细胞明显比阴性对照组高，动态反映亚二倍体阳性细胞形成高峰提前。另外，于共刺激培养12h时AnnexinV结合检测，实验组阳性细胞明显增多。说明PF18-3单抗与亚适量Con A共刺激促进了胸腺细胞的凋亡。这里要讨论的是，由于胸腺细胞是不均一的细胞群体，其接受活化信号刺激的应答也不相同。一般认为，在体外绝大多数不成熟的CD4＋CD8＋细胞（DP）接受刺激信号后进入凋亡〔9〕，而CD4＋/CD8＋单阳性（SP）则可能活化增殖，细胞扩增，小部分仍可凋亡〔10，11〕。那么PF18-3单抗促进的是哪群细胞的凋亡？我们以前的实验证明，PF18-3分子主要表达在Con A刺激的DP和CD4+SP胸腺细胞表面，是否固相PF18-3单抗促进了这两群细胞的凋亡，这对T细胞研究将有重要意义。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（39730410）；973资助项目(G1999053904)
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(收稿日期：1999-12-13)