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IL-8单克隆抗体的研制及其生物学活性研究
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 细胞因子
作者：刘继明 张毅 朱华亭 邱玉华 王江方 冯丽瑾 张学光
单位：刘继明 张毅 朱华亭 邱玉华 王江方 张学光(苏州医学院免疫室)；冯丽瑾(苏州第二人民医院检验科)
IL-8是机体主要的炎症因子之一，目前已知IL-8参与了多种疾病的发展和组织损伤〔1〕，如：类风湿性关节炎、牛皮癣、缺血回灌综合症(包括心肌梗死和多器官衰竭)、肾小球肾炎以及其他各类感染性疾病。鉴于IL-8是炎症性反应的一个重要因子，建立能快速和特异检测IL-8的方法和研制拮抗IL-8生物学活性的单抗，将为治疗和明确IL-8介导的炎症性病理损伤提供有效的手段。
材料与方法
IL-8单抗和多抗的制备：杂交瘤的建立和兔抗人IL-8多抗血清的制备按本室常规方法进行，抗体亚类用快速鉴定试剂条（argene biosoft，France）鉴定。
电泳和免疫印迹：电泳采用10%还原变性SDS-PAGE, 免疫印迹按常规方法进行。
抗体的生物学活性：IL-8在体外具有趋化中性粒细胞游走的作用〔2〕，体内注射IL-8可有效提高外周血白细胞的数量〔3〕，在这些实验中，通过加入适量IL-8单克隆抗体观察抗体对IL-8生物学活性的拮抗作用。
趋化试验〔2〕：96孔趋化板（ChemoTx, Neuro Probe），其膜厚10μm，孔径3μm。新鲜分离的外周血PMN(中性粒细胞)调节其浓度至106个/ml。上层加2μl的细胞悬液，下层加入29μl不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、100μg/ml)的抗体和10ng/ml IL-8，样品用0.5% BSA-RPMI 1640稀释, 对照样品为0.5% BSA-RPMI 1640。37℃ CO2培养箱放置40?min后，70%甲醇固定后吉姆萨液染色观察下层膜面上的细胞，用400×光学显微镜观察计算下层细胞数。
趋化指数=(样品迁移细胞数)/(对照样品迁移细胞数)
白细胞动员试验〔3〕：体重20g雄性BALB/c小鼠，每只注射1mg的不同抗体(SI96、SI97、SI98)和20μg IL-8，对照组仅注射生理盐水。45?min后用氯仿麻醉，心脏穿刺取血，EDTA抗凝。立即进行外周血白细胞常规计数。
动员指数=(实验组外周血白细胞数)/(对照组外周血白细胞数)
酶联检测法(ELISA)的建立：采用夹心放大法，其步骤：以100μl/孔2μg/ml的IL-8单抗包板，包板液为0.05mol/L pH9.6碳酸氢钠缓冲液，4℃过夜；用0.1% Tween20-PBS, pH7.4，洗2次后，用300μl 3％ BSA-PBS 37℃封闭2?h。之后分三步加入标准IL-8、兔抗IL-8多抗、ALP-羊抗兔球蛋白多抗(Imuno Tech Inc, France)，每一步都37℃反应2?h，洗4遍，最后加入底物（4-nitrophenyl phosphate disodium salt, Merck）显色。1?h后用1mol/L NaOH终止反应，405nm测吸光度（A）值。
结果和讨论
1.杂交瘤细胞株的建立：经筛选获得3株稳定分泌IL-8单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为SI96、SI97和SI98。SI96、SI97为IgM亚类，SI98为IgG1亚类。抗体纯化后经还原性SDS-PAGE检测证实，具有免疫球蛋白结构特征——重链和轻链区。免疫印迹检测显示，3株抗体可特异性识别位于相对分子质量（Mr）为9×103 处的标准IL-8抗原。在体内、体外均能明显抑制IL-8的生物学活性，在体外趋化实验中，随着加入抗体浓度的增加，3株抗体均能完全抑制IL-8对PMN的趋化活性。除此之外，我们还观察到一个有趣的现象，24孔板内新鲜分离的PMN中加入IL-8后，能使PMN迅速聚集成团，预先加入适当浓度的这3株抗体均能明显抑制这种聚集成团现象，联合应用效果更显著。上述实验表明，3株抗体均可作为拮抗IL-8生物学活性的拮抗剂。鉴于3株抗体均能拮抗IL-8生物学活性，将来在体内联合应用，可能对预防缺血回灌综合症会产生更好的效果。国外业已有人做IL-8的鼠源性单克隆抗体人源化工作，以便用于临床试验性治疗各种缺血回灌综合症，国内尚未见到用IL-8中和性抗体治疗缺血回灌综合症的相关性报道。因此我们建立的3株拮抗人IL-8生物学活性的鼠源性单抗，为将来开展动物实验性治疗各种缺血回灌综合症提供了良好的物质基础。
2.抗体生物学活性：以PMN为靶细胞，SI96、SI97和SI98在体外能明显抑制IL-8对PMN的趋化作用（图1），随着抗体浓度的增加，3株单抗均能完全抑制IL-8对PMN的趋化活性。在体内，3株抗体均可不同程度抑制IL-8对小鼠外周血白细胞的动员作用（图2）。抗体在体内、外具有拮抗IL-8生物学活性的作用。
图1 不同单抗对IL-8趋化活性的抑制作用
Fig 1. Inhibition of chemotactic activity of IL-8 by three McAbs
Control: anti B7-1 McAbs; IL-8 contentration: 10ng/ml
3.酶联检测结果
ELISA标准曲线及灵敏度：将测定的A值与IL-8浓度作半对数图。当标准IL-8浓度为14pg/ml，SI98包板的酶联检测A值为0.178±0.028，明显高于空白对照的A值(0.139±0.024)，所以其最高检测灵敏度可达14pg/ml。SI96和SI97因非特异性显色偏高，其检测灵敏度仅分别为123pg/ml和370pg/ml。以SI98建立的IL-8酶联检测吸附法，在14pg/ml至10ng/ml时的标准曲线相关系数为r=0.9793，呈高度相关性。用酶联法测定SI98与GM-CSF、rIL-1α、IL-6、TNF-α和IL-8家族中的MIP-1α无明显交叉反应。
许多炎症疾病包括各种白血病均有IL-8水平升高的现象〔4〕，及时检测和跟踪血清或组织液中的IL-8水平，将有助于进一步阐明IL-8生理、病理作用，明确其临床意义。为此我们利用SI98的高特异性，建立了一套检测IL-8的ELISA方法，其灵敏度明显高于普通的双抗夹心法和放免法，可用于特异性检测各种病理性升高的IL-8。
图2 抗体抑制IL-8升高外周血白细胞的作用
Fig 2. Inhibition of leukocytosis of IL-8 by McAbs
* Comparison with IL-8 group (t test, P＜0.05); IL-8 concentration (10μg/ml); Monoclonal antibody concentration (1mg/ml)
基金项目：江苏省科委优秀青年教师基金资助项目（BQ96016）；国防科工委基金资助项目(Y5573162-02）
刘继明(硕士研究生)，张学光(导师)
参考文献
1，Harada A, Sekido N, Akahoshi T, et al. Essential involvement of interleukin-8 (IL-8) in acute inflammation. J Leukoc Biol, 1994, 56:559-564.
2，Furuta R, Yamagishi J, Kotani H, et al. Production and characterization of recombinant human neutrophil chemotactic factor. J Biochem, 1989, 106:436-441.
3，Jagels MA, Hugli TE. Neutrophil chemotactic factors promote leukocytosis - A common mechanism for cellular recruitment from bone marrow. J Immunol, 1992, 148:1119-1128.
4，刘继明，曾慧兰，张毅，等. 白细胞介素8及其受体在急性白血病的表达及其意义. 中华血液学杂志, 1999, 20(1):24-26.
(收稿日期：1999-09-15)