点击显示 收起
hAR-N单克隆抗体免疫学特性的研究及其应用
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 检测技术
作者：沈敬华 刘彩云 马泓 刘美生 何洛文
单位：沈敬华(内蒙古医学院微生物教研室)；刘彩云 马泓 刘美生 何洛文(北京市肿瘤防治研究所)
前列腺癌组织中雄激素受体(AR)含量与术后采用抗雄激素疗法的反应程度、术后复发、转移率的发生密切相关〔1〕。AR的检测方法多为免疫组化法〔2〕。其所需试剂——AR McAb国内尚无，为此我们研制AR McAb。以美国Zymed公司AR多抗为标准对自制AR McAb性能进行鉴定，以便为临床和科研工作提供性能稳定可靠、质优价廉的免疫试剂。
材料与方法
动物：BALB/c小鼠，雌性，6～8周龄，购自北京医科大学动物实验中心。
抗原：hAR-N段20个氨基酸合成肽(该区具有高亲水性，与其它类固醇激素具有很少同源性)由北京大学生命科学中心芦永军教授合成。
骨髓瘤细胞系Sp2/0：北京生物制品研究所引进，液氮保存。
前列腺癌标本：内蒙古医学院病理室提供。
进口hAR多抗、Biotin-马抗小鼠IgG：均为Zymed公司产品。
hAR-N段合成肽与KLH偶联法：同文献〔3〕。
AR McAb制备、筛选：以AR-KLH交联物为抗原，免疫BALB/c小鼠，皮下多点注射，免疫3次，每次免疫间隔2周，取脾制备细胞悬液与Sp2/0细胞按常规方法进行融合-筛选-有限稀释，3次克隆化后，扩大培养。
腹水诱生：成年雌性BALB/c小鼠提前1周腹腔注射降植烷和弗氏不完全佐剂各0.2ml进行预处理，腹腔注射杂交瘤细胞悬液5×106～1×107，9～10?d处死BALB/c小鼠收集腹水。
杂交瘤细胞染色体分析：生长好的AR杂交瘤细胞加秋水仙素10μl/5ml，放37℃ 2～4?h，离心弃上清，加0.075mol/L KCl 8ml，37℃ 10～30?min后，固定液固定，涂片镜检。
Ig亚类测定：收集杂交瘤细胞培养上清反复冻融浓缩3次，与Ig亚类抗血清进行琼脂双扩散试验。
效价测定：采用ELISA方法，以hAR-BSA交联抗原0.5μg/孔包板，将培养上清腹水及纯化的抗体按一定比例稀释后,测定阳性终点。
特异性测定
与无关抗原的交叉反应性：用ELISA方法，将所得AR单克隆抗体与HAS、BSA、PR抗原反应，测其有无交叉反应，其中抗原均以1μg/孔包板。
Western blot：由前列腺癌组织提取蛋白，进行SDS-PAGE，按常规电转移至硝酸纤维素（NC）膜上，0.3% BSA封闭，AR McAb以下步骤同SP法。
IHC结果判定标准：癌细胞核呈棕色颗粒者为阳性细胞。免疫组化染色切片使用北航HI-CI真彩图像分析系统进行测定。所测指标为：(1)阳性物含量，(2)阳性物平均灰度，(3)阳性物平均吸光度，(4)阳性物积分吸光度。为避免仅以某一因素的考虑不平衡性，将染色灰度值与阳性物含量乘积作为免疫反应分值（immunorective score， IRS)，并根据统计需要将IRS均值四舍五入，按五级记分：0为1(-); 1～5为2(±); 6～10为3(+); 11～20为4(++); ＞20为5(+++)进行统计分析。
结果与讨论
抗hAR-N McAb杂交瘤细胞株建立：融合后经多次克隆化，建立了4株能稳定分泌抗hAR-N McAb的杂交瘤细胞株55、141、207、257。显微镜下计数100个中期核细胞染色体为88～108条，Ig亚类均为IgM，与PR、BSA、HSA等抗原作交叉反应试验，结果均呈阴性，腹水效价为1∶105，培养上清为1∶103，纯化后的腹水效价为1∶105。
Western blot：自制AR McAb对转移至NC膜上的前列腺癌组织蛋白提取物在相对分子质量为114×103处呈现特异性的反应带，见图1。
免疫组化应用分析：自制hAR-N McAb IHC染色阳性产物主要定位于胞核。随机取经病理确诊的前列腺癌手术标本的石蜡切片30例，分别用自制hAR-N McAb及进口hAR多抗进行IHC检测，阴、阳总符合率为93.8%，强度反应符合率为97.7%。统计学分析：r=0.88。P＜0.0001。抗原修复与抗原不修复石蜡切片的IHC结果之间有良好吻合性; 两者总符合率90.6%，阳性程度总符合率94.7%。统计学分析：r=0.87，P＜0.0001(见表1)。
图1 Western免疫印迹分析结果
M：marker，1：进口AR，2：自制AR McAb
表1 石蜡片AR表达阳性率强度及IRS值(
| 抗体 | 抗原
修复 |
前列腺癌 | |||||||
| n | - | ± | + | ++ | +++ | 阳性率 | IRS ( | ||
| 进口AR多抗 | + | 30 | 3 | 1 | 7 | 15 | 4 | 90% | 11.816±8.862 |
| 自制AR McAb | - | 30 | 2 | 0 | 6 | 16 | 6 | 93% | 12.865±6.361 |
| 自制AR McAb | + | 30 | 3 | 1 | 5 | 16 | 5 | 90% | 11.316±5.162 |
检测AR表达水平对临床制订合理治疗方案具有重要意义，AR单克隆抗体是进行AR IHC检测的基础。由于AR在大多数靶细胞组织中表达量低并对蛋白分解酶敏感，与其它类固醇激素具有高度同源性，使AR抗原的获得比较困难。目前国内没有AR单抗的销售，为此，我们分析了AR cDNA全序列的基础上，选择AR-N端，该区具有高亲水性，与其它类固醇激素具有很少同源性。采用氨基酸合成技术制备含有20个氨基酸的合成肽，从而获得足量的AR抗原，以此制备的hAR McAb灵敏性好，特异性高，与进口hAR多抗同时对30例前列腺癌石蜡切片进行检测，阴、阳符合率达93.8%。用国外多抗，IHC检测必须用微波炉行抗原修复，步骤繁琐，而自制AR McAb无需抗原修复这一极易脱片的步骤，可得到同样一致的免疫组化染色结果。上述AR McAb经Western blot鉴定，与进口AR多抗均在AR蛋白相对分子质量114×103处显现强反应带（图1），验证其与天然的AR蛋白具有特异的免疫结合反应。
综上所述，自制hAR单抗是特异的临床检测肿瘤组织AR水平的抗体，可以代替进口AR多抗用于临床及科研工作。 参考文献
1，谢庆祥. 雄激素受体与前列腺癌关系的研究进展．国外医学泌尿系统分册，1997，17（11）；11-13．
2，Hawkins RA. Histochemical studies of human breast cancer using a monoclonal antibody against an oestrogen receptor-related antigen. Br J Cancer, 1987, 55：611-618．
3，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis. Molecular cloning a laboratory manul, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989, P18.
(收稿日期：1999-11-19)