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金黄色葡萄球菌L型对猴肾细胞致病变作用的研究

来源:中华微生物学和免疫学杂志
摘要:金黄色葡萄球菌L型对猴肾细胞致病变作用的研究中华微生物学和免疫学杂志2000年第6期第20卷细菌学作者:夏佩莹刘勇汪万英单位:夏佩莹刘勇(蚌埠医学院微生物学教研室,233003)。汪万英(蚌埠医学院附属医院病理科)关键词:金黄色葡萄球菌L型。细胞株。聚合酶链反应【摘要】目的研究细菌L型在体外......

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金黄色葡萄球菌L型对猴肾细胞致病变作用的研究

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 细菌学

作者:夏佩莹 刘勇 汪万英

单位:夏佩莹 刘勇(蚌埠医学院微生物学教研室,233003);汪万英(蚌埠医学院附属医院病理科)

关键词:金黄色葡萄球菌L型;细胞株;免疫组织化学;聚合酶链反应

  【 摘要 】 目的 研究细菌L型在体外培养的单层细胞中的致病作用。方法 用金黄色葡萄球菌(金葡菌)、金葡菌稳定L型及经0.45μm滤过的L型原生小体感染猴肾细胞。结果 发现金葡菌L型及滤过的原生小体对细胞致病性降低,细胞不出现明显病变,部分细胞出现空泡样变,免疫组化及金葡菌PCR显示感染细胞内出现金葡菌抗原及DNA。结论 细菌L型在感染细胞中可出现类似病毒的致病特点,L型可在细胞内长期存在而不出现明显的细胞病变,其DNA可否与细胞DNA整合值得进一步研究。

Cytopathic effect of Staphylococcus L-forms on monkey kidney cells

XIA Peiying, LIU Yong, WANG Wan

  (ying. Department of Microbiology, Bengbu Medical College,Bengbu 233003,P.R.China)

  【 Abstract 】 Objective To study the cytopathic effect of L-form in the monolayer cell culture.Methods Monolayer monkey kidney cells (MA104) were infected separately with bacterial forms of Staphylococcus aureus, their L-forms and elementary bodies.Results No apparent cytopathic effects (CEP) could be observed during the first 24 hours of infection with L-form and elementary bodies, but the cytoplasm of some MA104 cells became vacuolated when the L-forms entering into the cells as shown by immunohistochemical staining and PCR.Conclusion The cytopathic effect of L-forms was very similar to that of virus. Whether the DNA of L-forms could be integrated with the DNA of cells and influence their differentiation are questions for more research.

  【 Subject words 】 Staphylococcus aureus L-form; Monolayer monkey kidney cells; Immunohistochemical; PCR

  细菌L型的临床病变特征与病毒相似已得到证实〔1,2〕。近年来有学者报道,细菌L型有致细胞突变可能,与肿瘤发生和致畸有关〔3〕。为深入研究细菌L型的这一致病机理,我们用金葡菌L型接种猴肾细胞株,并于感染后不同时间观察细胞病变、金葡菌L型免疫组化及PCR检测结果,以期用单一致病因素对细胞作用的方式来探讨细菌L型的致病性。

  材料与方法

  菌种:金葡菌CowanⅠ株:由中国药品生物制品检定所提供。金葡菌L型:用常规方法诱导金葡菌CowanⅠ株成稳定L型〔1〕。用无菌生理盐水分别将细菌型、L型的24 h培养物洗下制成108 CFU/ml的悬液,另外,将洗下的金葡菌L型悬液用0.45μm无菌滤膜滤过,收集滤液(其中主要为细菌L型的原生小体)。

  传代组织细胞:猴肾细胞MA104株,由安徽省医研所提供,营养液用RPMI 1640营养液,消化液采用EDTA。

  感染及观察:用MA104株猴肾细胞作传代细胞培养,将细胞经EDTA消化后,加入生长液,制成约30万/ml细胞悬液,分装于培养瓶中,每瓶约3ml,放入无菌盖玻片,37℃培养,待细胞在玻片上长成单层后,吸去陈旧生长液,加入维持液3ml,用金葡菌、金葡菌L型、0.45μm滤膜滤过的金葡菌L型各0.1ml分别加入细胞培养瓶中,置37℃孵育,同时设不加菌液的正常对照,各培养瓶每12 h观察1次。感染细胞经48 h观察仍未出现明显细胞病变者按常规方法消化传代。

  金葡菌L型免疫组化(S-P法):一抗为兔抗金葡菌、兔抗金葡菌L型特异性抗体(本室制备,使用时1∶2 500稀释),二抗为羊抗兔IgG(由福州迈新公司提供)。取出培养瓶中长满细胞并经感染的盖玻片→蒸馏水充分洗涤→pH7.4 PBS洗5 min×3次→加0.3% H2O2甲醇溶液,室温20 min→pH7.4 PBS洗5 min×3次→加未免疫兔血清,室温20 min→吸去多余液体,勿洗,加第一抗体,4℃ 36 h→PBS洗5 min×3次→加生物素标记的第二抗体,室温20 min→pH7.4 PBS洗5 min×3次,加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液,室温20 min→pH7.4 PBS洗5 min×3次→DAB显色后用自来水冲洗,苏木素复染,中性树胶封固。同时做省略一抗(PBS代替)、省略二抗、健康非免疫兔血清代替一抗等空白对照。

  金葡菌PCR测定:PCR试剂盒为华美公司产品,扩增序列为280bp。将经金葡菌L型和0.45μm滤膜滤过的金葡菌L型感染的24 h、48 h培养细胞用EDTA消化后洗下,以Hanks液500r/min低速离心5 min,反复5次以上,洗去细胞外溶液中的金葡菌L型,将上清和沉淀分别作金葡菌PCR检测,按常规方法进行。

  结果

  1.细胞形态:正常对照的细胞生长良好,细胞呈梭形,无病变,无脱落,核仁清晰(图1)。金葡菌细菌型感染的细胞12 h后已有部分细胞坏死脱落;24 h后细胞大部分脱落,残存细胞胞浆疏松变淡,核仁不清,部分细胞核破碎(图2);48 h后几乎无完整细胞,瑞氏染色可见有大量细菌。金葡菌L型感染的细胞24 h后细胞形态基本正常,未见细胞脱落(图3);48 h后细胞有少量脱落,细胞体积较正常增大,部分胞浆内出现空泡,细胞浆内可见细菌L型圆球体。经0.45μm滤过的金葡菌L型感染细胞48 h后,细胞未见明显病变,传代细胞至第8代,细胞形态仍正常,此后细胞老化丢弃。

  图1 正常猴肾单层细胞(100×)

  Fig 1. Normal monolayer monkey kidney cells(100×)

  2.免疫组化:金葡菌L型及经0.45μm滤过的金葡菌L型原生小体感染细胞48 h后用金葡菌L型抗体作免疫组化发现,病变细胞内有金葡菌L型抗原表达,整个细胞呈浅棕色,细胞核、胞浆中见棕色阳性颗粒,正常对照细胞为阴性。

  图2 金葡菌细菌型感染24 h后猴肾细胞(100×)

  Fig 2. Monolayer monkey kidney cells by infected S. aureus for 24 h (100×)

  图3 金葡菌L型感染24 h后的猴肾单层细胞(100×)

  Fig 3. Monolayer monkey kidney cells by infected S. aureus L-form for 24 h(100×)

  3.PCR检测:将金葡菌L型感染的细胞及经0.45μm滤过的金葡菌L型感染的细胞培养48 h后,低速离心、取沉淀细胞、洗涤,反复5次后分别取细胞及上清液作金葡菌PCR检测,发现细胞管均为阳性,而上清液为阴性(图4)。

  图4 金葡菌L型感染猴肾细胞PCR

  Fig 4. PCR of kidney cells were infected by S.aureus L-forms

  A: Markers; B: Negative control; C: Positive control; D: Supernatant of cell infected by S.aureus L-forms for 24 h; E: Cells infected by S.aureus L-form for 24 h; F: Supernatant of cell intected by S.aureus elementary bodies for 48 h; G: Cells infected by S.aureus elementary bodies for 48 h

  讨论

  关于细菌L型对体外培养组织细胞的致病作用,曾有少量报道〔4〕。本实验发现细菌L型致细胞病变作用(CPE)较原菌弱,感染后48 h细胞有少量脱落,部分细胞内出现空泡,体积较正常细胞略大。Kita〔5〕曾报道,从鼠伤寒沙门菌L型中分离到一种细胞毒素可导致体外培养的细胞出现病变,提示细菌L型仍具有一定的CPE作用,但致病性较原菌为弱。未经滤过的细菌L型中含有细胞壁缺陷程度不同的原生小体、圆球体、巨形体等,经0.45μm滤过的细菌L型中基本上均为细胞壁完全缺失的原生小体,感染细胞48 h后仍未出现细胞病变,且可正常传代至8代,说明原生小体的CPE作用较其它形态的L型更弱,细菌L型对体外培养细胞的致病变作用可能与细胞壁缺失程度和L型的稳定性有关,值得进一步研究。

  细菌L型感染后细胞内出现空泡值得探讨。病毒在感染的组织细胞内常出现空泡(凹空细胞),并作为某些病毒如乳头状瘤病毒感染的诊断指标。但已有学者发现:在出现凹空细胞的病理切片中,金葡菌L型的免疫组化检出率为65.5%,认为细菌L型感染也是引发凹空细胞病变的重要原因之一〔6〕。本实验从单层细胞培养的单一感染因素中证实细菌L型感染后确可使细胞出现凹空样变性,进一步证明细菌L型的某些致病特性与病毒有相似之处,凹空细胞并非为某些病毒感染的特征性改变。

  细菌L型感染后细胞免疫组化染色证实,在无明显CPE的细胞中有金葡菌L型抗原存在,同时金葡菌PCR阳性,而反复离心后上清液中为阴性,排除了培养液中残存细菌导致假阳性的可能。证明细胞内已有L型细菌进入。至于进入细胞的L型菌能否与DNA整合,导致细胞畸变、突变以及L型原生小体感染的细胞经多次传代后其DNA中有无细菌基因存在,尚有待深入研究。

  基金项目:安徽省自然科学基金资助项目(95-医-15)

  参考文献

  1,林特夫. 细菌L型的生物学性状与致病性. 见: 黄谷良, 林特夫, 郭秉兰, 主编. 细菌L型与疾病. 北京: 学苑出版社, 1991, 66-87.

  2,张世馥. 细菌L型的病理学. 见: 黄谷良,林特夫,郭秉兰, 主编. 细菌L型与疾病. 北京: 学苑出版社, 1991, 122-130.

  3,汪万英, 何杰, 姚敏, 等. 金葡菌及其L型感染荷瘤小鼠的实验研究. 中国微生态学杂志, 1996, 8(5):38.

  4,居弘, 黄谷良, 林特夫. 链球菌感染中L型致病作用的研究. 蚌埠医学院学报, 1991, 11(1):29-31.

  5,Kita E, Kamikaidou N, Nakano A, et al. Isolation of a cytotoxin from L-form Salmonella hyphimurium. FEMS Micobiol Lett, 1993, 109(2-3):179-184.

  6,于东红, 王萍. 细菌L型与人乳头状瘤病毒致凹空细胞的比较. 蚌埠医学院学报, 1997, 9(2):50-52.

(收稿日期:1999-09-13)


作者: 风清扬 2009-2-21
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