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中图分类号：R373.9 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0111-05
Study on Human Cytomegalovirus (HCMV) Infection in the Blood Donors
LI Chun-ying,LU Chun-lan,YU Dong-wei et al.
(Inner Mongolia Health and Anti-epidemic Station,Huhhot 010020)
Abstract:HCMVs in blood leukocytes and in serum from the same blood donor were examined by polymerase chain reaction (PCR) and DNA hybridization technique.In the mean time,HCMV-IgM and HCMV IgG in the serum were examined by ELISA.Two hundred blood leukocyte samples and 200 serum samples were examined in a successive two years period.HCMV positive rates for the blood leukocytes by PCR in the different years were 63% and 70% while the positive rates by DNA hybridization were 42% and 50%,respectively.HCMV postive rates for the serum by PCR in the different years were 49% and 53% while the positive rates by DNA hybridization were 33% and 39%,respectively.A 5% HCMV-IgM positive rate was found in the two years while 54% and 58% HCMV-IgG positive rates were found in the two different years.
Key words:Blood donor; Leukocyte; Serum; HCMV; Antibody
人类巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)感染在免疫功能正常的健康人极少出现临床症状，而在免疫功能低下或缺失的患者可能会发展成有严重临床症状的CMV病。输血是HCMV感染的主要途径之一［1］。HCMV感染可导致死胎、早产、畸形、新生儿巨细胞包涵体病和间质性肺炎等多种疾病，并与器官移植排斥反应有关。为了解献血员中HCMV感染状况以及寻找一种比较简便的实验方法，我们采用PCR法和DNA杂交法检测了同一献血员的白细胞及血清，并与血清中检出的HCMV-IgG、IgM抗体结果比较，发现HCMV-DNA的检出与HCMV-IgG抗体的检出有很高的一致性。因此，我们提出可用HCMV-IgG抗体作为HCMV感染的指标，现将结果报道如下：
1 材料与方法
1.1 病毒标本 在内蒙古自治区中心血站采集经ALT、HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、RPR等检测阴性的同一献血员血清、全血各100人份，共采两年。用自然沉降法分离外周血液中的白细胞。血清、白细胞置低温冰箱保存。
1.2 HCMV-DNA提取 取待测样品100μL与等量裂解液混匀，经消化、煮沸、离心后，取各实验所需量分别进行PCR和DNA杂交实验。
1.3 试剂来源 PCR扩增试剂盒、DNA杂交试剂、ELISA试剂盒均购自北京京师生物工程技术公司。操作及结果判定均按试剂说明进行。
2 结果
2.1 献血员中HCMV-DNA阳性率
采用DNA杂交法及PCR法对连续两年采集的献血员血清及同份血样白细胞各100人份进行HCMV-DNA检测。1996年献血员白细胞中HCMV-DNA检出率为42%(DNA杂交法)和63%(PCR法)，血清中HCMV-DNA检出率为33%(DNA杂交法)和49%(PCR法)。1997年献血员白细胞中HCMV-DNA检出率为50%(DNA杂交法)和70%(PCR法)，血清中HCMV-DNA的检出率为39%(DNA杂交法)和53%(PCR法)。对两种方法的灵敏度进行比较，显示PCR法检测白细胞和血清HCMV-DNA的阳性率均高于DNA杂交法(X2=8.84，5.29，8.33，3.94，P＜0.05)。采用PCR法在白细胞中检出的HCMV-DNA阳性率明显高于血清中的HCMV-DNA阳性率(X2=3.98，6.10，P＜0.05)，而用DNA杂交法检测白细胞及血清中的HCMV-DNA，其阳性率则基本一致(X2=1.73，2.44，P＞0.05)。检测结果见表1。
表1 献血员白细胞及血清中HCMV-DNA检测结果
Table 1 Examination of HCMV-DNA in leukocytes and sera of blood donors
| 时间
Time (年，a) |
检测数
Sample numbers |
阳性数
Positive numbers | ||||
| 白细胞
Leukocyte |
血清
Serum |
DNA杂交法
DNA hybridization |
PCR法
PCR method | |||
| 白细胞
Leukocyte |
血清
Serum |
白细胞
Leukocyte |
血清
Serum | |||
| 1996 | 100 | 100 | 42(42.0) | 33(33.0) | 63(63.0) | 49(49.0) |
| 1997 | 100 | 100 | 50(50.0) | 39(39.0) | 70(70.0) | 53(53.0) |
| 合计
Total |
200 | 200 | 92 | 72 | 133 | 102 |
2.2 献血员中HCMV特异性抗体检测 采用ELISA法对连续两年的献血员血清进行了HCMV-IgG、HCMV-IgM检测。1996年血清中的IgG阳性检出率分别为54%(1∶100，1∶400)，38%(1∶1600)，16%(1∶6400)。1997年血清中的IgG阳性检出率分别为58%(1∶100，1∶400)，47%(1∶1600)，17%(1∶6400)。两年的血清IgM阳性检出率均为5%。在这10份IgM阳性的血样中，3份血样的白细胞及血清中均检出了HCMV-DNA(PCR法)，同时HCMV-IgG也阳性。其余的7份血样，仅用PCR法在白细胞中检出了HCMV-DNA。
2.3 PCR法检测HCMV-DNA与ELISA法检测HCMV特异性抗体的关系
比较用PCR法及ELISA法(1∶100或1∶400)，检测1996、1997年各100人份血样结果。1996年的血样中，有44份在白细胞及血清中均检出了HCMV-DNA，且其血清中的HCMV-IgG抗体也阳性。而在用PCR法检出HCMV-DNA的63份白细胞血样中，有49份在血清中检出了HCMV-IgG，符合率为77.8%。在剩下的5份IgG阳性样品中，用其他检测法在血清或白细胞中也检测到了HCMV-DNA，其血样中HCMV-DNA的阳性数与血清中IgG抗体的符合率为85.7%。同样在1997年的51份血样中，白细胞及血清中同时检测到了HCMV-DNA及HCMV-IgG抗体，在用PCR法检出的HCMV-DNA的70份白细胞血样中，有54份血清中HCMV-IgG抗体也阳性，符合率为77.1%。同样在剩下的4份IgG阳性样品中，用其他检测法在血清或白细胞中也检测到了HCMV-DNA，其HCMV-DNA的阳性数与IgG抗体的符合率为82.9%。将血清中HCMV-IgG抗体阳性数以及将HCMV-IgG与HCMV-IgM抗体阳性数之和，与用目前敏感性最强的PCR法在同份血样检出HCMV-DNA阳性数最高的白细胞中的阳性数相比，结果见表2。
表2 PCR法检测HCMV-DNA与ELISA法检测HCMV抗体结果比较
Table 2 Comparison of PCR and ELISA for HCMV examination
| 时间
Time (年，a) |
PCR
Positive numbers |
ELISA
Positive numbers | ||||
| 白细胞
WBC |
血清
Serum |
白细胞及血清
WBC & Serum |
IgG | IgM | IgG+IgM | |
| 1996# | 63 | 49 | 44 | 54(85.7)* | 5 | 58(92.1)* |
| 1997# | 70 | 53 | 51 | 58(82.9)* | 5 | 61(87.1)* |
#白细胞和血清检测数均为100人份 #100 samples for dection of leukocyte and serum
*与白细胞中PCR(+)的符合率*Corresponding rate with PCR (+) in leukocyte2.4 献血员血清中HCMV-IgG抗体与被检者性别及献血年限的关系
对200名献血员按献血年限(1～2，3～4，5～6，7～8，9～10，10以上)进行分组，其献血年限与HCMV-IgG抗体阳性的分布见表3。从表3可看出，献血员中HCMV-IgG阳性率随献血年限增加而增高，而与性别无显著性关系。
表3 献血员血清中HCMV-IgG抗体与献血者性别及献血年限的关系
Table 3 Relationships between HCMV-IgG and sexuality of donor and duration of donation
| 献血年限(年)
Duration(a) |
男
Male |
女
Female |
合计
Total | ||||||
| 例数
Case |
阳性数
Posit. |
阳性率(%)
Posit.% |
例数
Case |
阳性数
Posit. |
阳性率(%)
Posit.% |
例数
Case |
阳性数
Posit. |
阳性率(%)
Posit.% | |
| 1～2 | 13 | 3 | 23.0 | 3 | 0 | 0 | 16 | 3 | 18.8 |
| 3～4 | 15 | 5 | 33.3 | 14 | 2 | 14.3 | 29 | 7 | 24.1 |
| 5～6 | 19 | 8 | 42.1 | 16 | 7 | 43.8 | 35 | 15 | 42.9 |
| 7～8 | 21 | 11 | 52.4 | 16 | 11 | 68.8 | 37 | 22 | 59.5 |
| 9～10 | 18 | 12 | 66.8 | 7 | 6 | 85.7 | 25 | 18 | 72.0 |
| ＞10 | 34 | 27 | 79.4 | 24 | 20 | 83.3 | 58 | 47 | 81.0 |
| 合计
Total |
120 | 66 | 55.0 | 80 | 46 | 57.5 | 200 | 112 | 56.0 |
3 讨论 早在1985年就有人认为白细胞是HCMV的重要潜伏部位之一，临床经验也表明，接受白细胞输入的患者，其HCMV感染的危险性显著增加［2］。但在1996年Hackstein［3］等人用免疫细胞化学法及反转录PCR法并未证明献血员白细胞是HCMV的主要潜伏场所。他们认为经输血传播HCMV的可能原因是极少的吞噬细胞暂时吞噬了受感染内皮细胞中的HCMV。而1998年Larsson［4］等人发现，对HCMV敏感的单核白细胞均携带有CD13表面分子，并采用针对HCMV两个特殊基因的引物设计的PCR法证实了这一设想，因而提出HCMV仅在携带CD13的外周单核白细胞中复制。而我们的实验结果表明，用PCR法检测白细胞与血清中的HCMV-DNA，其阳性检出率有显著差异，而采用DNA杂交法，其阳性检出率无明显差异。检出率的不同主要与方法学有关。
聚合酶链反应技术(PCR法)被认为是目前敏感度高的基因检测手段之一，其较高的HCMV阳性检出率在白细胞及全血中均有报道［5，6］。但我们应用PCR试剂盒，在连续2年的献血员血清及白细胞中，HCMV-DNA的检出率分别是49%和53%，63%和70%。我们所用的PCR法其引物采用相对保守区域的一对基因片段，以出现170bp的DNA扩增带为感染阳性。而目前使用的各种检测HCMV的PCR试剂，扩增后的阳性指示条带有多种(435、160、400bp等等)。因此，我们认为出现这种不同阳性率的原因，可能与不同PCR方法的引物不同有关。
输血是造成HCMV感染的主要原因之一，一般认为供血者的血液是否具有感染性，主要看其血液中是否有HCMV-DNA。我们采用ELISA法对献血员的血清进行HCMV-IgG、IgM检测，其IgM的检出率与国内外报道的基本一致［7，8］。IgG的检出率在两年中分别为54%和58%。与国内多数报道IgG的阳性率86%～98%相比，我们测到较低IgG阳性率可能与所用试剂有关。但1973年Krech［9］报道世界五大洲献血员的HCMV的抗体阳性率在西欧、美国、澳大利亚为40%～79%，第三世界国家则高达81%～100%，并且认为同一国家的不同地区HCMV抗体阳性率也可能有很大变化，且HCMV抗体阳性率与营养状况、居住条件等有一定关系。根据我们的调查结果，将IgG的阳性率与白细胞和血清中的HCMV-DNA的检出率相比，两者之间具有高度的一致性。HCMV-IgM阳性一般反映近期感染，HCMV-IgG阳性则表明既往感染。因此，我们认为可用ELISA法检测HCMV-IgG、IgM抗体作为高危献血员的常规筛检方法，这对减少和避免输血后CMV感染，尤其是对预防器官移植者、免疫功能低下者、小儿、孕妇以及未育女性的感染更为重要。此方法操作简便、快速、易于标准化、准确性高，也容易为基层医务人员所掌握。
内蒙古自治区卫生厅科研资助项目(NWK960027)
李春英(1958年-),女,河南省方城县人,副主任检验师,学士,主要从事医学病毒学研究.
参考文献
［1］Griffiths PD.Current management of cytomegalovirus diseases ［J］.Med Virol,1993,(Suppl 1):106
［2］Schrier RD,Nelson JA,Oldstone MB.Detection of human cytomegalovirus in peripheral blood lymphocytes in a natural ［J］.Science,1985,230:1048
［3］Hackstein H,Bottcher K,Merz H,et al.Blood leukocytes are not a primary latent site of cytomegalovirus ［J］.Beitr Infusionsther Transfusionsmed,1996,33:235～240
［4］Larsson S,Soderberg-Naucler C,Moller E.Productive cytomegalovirus (CMV) infection exclusively in CD13-positive peripheral blood mononuclear cells from CMV-infected individuals:implications for prevention of CMV transmission ［J］.Transplantation,1998,65(3):411～415
［5］Stanier P,Kitchen AD,Taylor DL,et al.Detection of human cytomegalovirus in peripheral mononuclear cell and urine samples using PCR ［J］.Mol Cell Probes,1992,6(1):51～58
［6］陈金东，邱定红，单祥年，等.献血员中巨细胞病毒感染的PCR检测［J］.中华血液学杂志，1994，5(15)：254～255
［7］Wilhelm JA,Matter L,Schopfer K.The risk of transmiting CMV to patient receiving blood transfusion ［J］.J Infect Dis,1986,154:169
［8］赵澄泉，邵济钧.青岛地区献血员HCMV特异性抗体检测［J］.中华流行病学杂志，1989，10：78
［9］Krech U.Complement fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world ［J］.Bull WHO,1973,49:103