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中图分类号：R373.2＋1；Q522 文献标识码：A
文章编号：1000－8721（2000）03-0266-04
Detection of Hepatitis C Virus RNA by Circulatory Reverse transcription-PCR
CHEN Ran，WU Di，TANG Rong，WANG Jin，MAO Yu-min（State Key Laboratory of Genetic Engineering, Institute of Genetics, Fudan University, Shanghai 200433, China）
Abstract: Circulatory reverse transcription (CRT) reaction is a new technique which can linearly increase cDNA products of reverse transcription reaction and is applied to detect Hepatitis C virus (HCV) RNA. By varying the cycles of CRT, along with the competitive PCR method, we have produced a standard curve. 136 HCV-positive blood samples, 54 HCV-negative blood samples (detected by ELISA) and 108 clinical blood samples were detected with 16 cycles of CRT plus 34 cycles of PCR and a comparative analysis with RT-PCR and NT-PCR detection was conducted. The HCV RNA totally positive rates were 57.9%, 35.6% and 58.6% respectively. The result indicates that the CRT-PCR is a convenient device to enhance the sensitivity of RNA detection and can be applied in the quantification of RNA.
Key words: circulatory reverse transcription (CRT); RT -PCR; HCV; quantitative competitive PCR (QC-PCR)
FD－耐热逆转录酶（FD－thermostable reverse transcriptase，FD－TRT）是由本实验室发现并生产［1，2］。根据该酶能耐受使核酸变性的高温，并在较高温度下保持逆转录催化活性的特性，我们发明了循环逆转录（CRT）（已申请国家发明专利）：在逆转录反应中引入高温变性和低温退火延伸的循环过程，通过控制温度变化，反复利用起始的RNA作为模板进行逆转录，可以得到拷贝数几十倍于模板RNA的cDNA，从而提高RNA检测和分析的灵敏度。
直接检测血样中HCV RNA是判断HCV感染及传染性的可靠指标，被感染者体内病毒的含量与临床发病情况、治疗的反应性及预后相关，因此，对HCV RNA的定量检测具有重要的临床意义。但HCV感染者血液中的病毒数量很少，所以一般应用巢式PCR（nested primers－PCR），采用二步PCR扩增，以提高检测的灵敏度，然而巢式PCR增加了引物设计的难度和实验的复杂性，而且操作技术要求高而繁琐，易导致PCR产物污染，定量分析很困难，成本较高等，因此不利于推广应用［3，7］。本实验中，应用CRT－PCR对血清HCV RNA进行了检测研究，并结合定量PCR技术，通过作出定量标准曲线，验证CRT是线性增长过程。结果提示，通过改变CRT的循环数，即可得到定量PCR所需的起始模板量的梯度变化。
材料与方法
1 样品来源 136例抗－HCV ELISA 阳性和54例抗－HCV ELISA阴性血清，来自于献血人群（检测采用上海科华实业生产的试剂盒），由上海第二医科大学免疫室提供。108例肝功能指标异常临床检验样品，由安徽省巢湖地区中心血站提供。
2 RNA模板 采用异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法并略加改进［4］。RNA溶于DEPC处理过的无菌水中。
3 引物 引物位于HCV序列5＇－NS区，由上海生工生物工程公司代为合成，其序列如下（OP1和IP1近3＇端有变异，OP1 34和35位核苷酸、IP1 59位核苷酸有变异，但不影响扩增［3，6］）：
OP1，位于正链18～38：5＇－GGCGACACTCCACCATAGATC
OP2，位于负链446～426：5＇－GTAAACTCCACCAACGATCTG
IP1，位于正链46～65：5＇－CTGTGAGGAACTACTGTCTTC
IP2，位于负链341～321：5＇－GGTGCACGGTCTACGAGACCT
4 RT反应 20μl体系中含：Tris－HCl（pH8.2，25℃）25mmol／L，（NH4）2SO4 15mmol／L，MnCl2， 2.0mmol／L，dNTP0.5mmol／L，DTT1.0mmol／L；明胶0.1mg／ml，逆转录引物（OP2）1.0μmol／L，FD－TRT0.5U，HCV RNA模板2μl。以液蜡封住液面，于65℃保温300s。
5 CRT及巢式PCR第一轮扩增 上述RT反应结束后，除一部分直接用于下面PCR外，另外的分别按下面2种步骤进行反应后再进行PCR：
（1）CRT：94℃ 40s，65℃ 200s，循环数设为1～33次。不同循环次数的CRT分别在各自预定的循环数完成后，以沸水浴300s终止反应。
（2）巢式PCR：补充OP1引物后，94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 60s；30次循环。
6 PCR扩增及电泳
20μl体系中含：Tris－HCl（pH8.2，25℃）10mmol／L，KCl 50mmol／L，MnCl2 2.5mmol／L，dNTP0.2mmol／L，DTT 1.0mmol／L；明胶0.1mg／ml，PCR引物IP1和IP2各1.0μmol／L，甲酰胺8％，Taq酶0.5U，逆转录产物2μl。以液蜡封住液面。特异扩增片段长度为297bp。对于定量PCR，另外加入采用随机扩增——克隆法构建的对照模板QC－DNA（具体方法将另文发表）3×10－9μg，对照扩增片段长度为454bp。
反应在Hybaid UK热循环仪上进行，程序为93℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 60s，循环数设为32次，最后于72℃保温300s。
反应结束后，取出10μl扩增产物于1.5％的琼脂糖凝胶上（含EB 0.5μg／ml）电泳分离，电泳缓冲液为1×TAE，电压80V（5V／cm），电泳1h，用FR980生物电泳图像分析系统分析，拍照记录。定量分析方法参照Tsai和Wiltbank的方法进行［8］。扫描记录DNA条带光密度值，计算HCV DNA扩增带对QC－DNA扩增带的光密度比值，取对数，采用Microcal Origin5.0系统分析作图。
结 果
1 循环逆转录－PCR
采用相同的逆转录体系和温度时间参数，改变逆转录反应的循环数，然后用相同的PCR体系和程序进行扩增，通过比较PCR产物量的变化，研究CRT增加逆转录产物量的效果。为了避免PCR扩增平台效应的影响，将PCR循环数控制在29次。从电泳结果可以看出，CRT的PCR扩增量明显多于普通逆转录，而且随着CRT循环数的增加而增多（图1a）。采用竞争定量PCR（quantitative competitive PCR，QC－PCR），对CRT增长cDNA量进行定量分析（PCR循环采用34次）。通过改变HCV RNA CRT的循环数，然后与QC－DNA（3×10－9μg～100个拷贝）进行共扩增，根据电泳结果（图1b），作出lg（HCV－DNA／QC－DNA）－lg（CRT－Cycles）拟合标准曲线为一条直线（图1c），说明CRT是线性增长过程。
2 HCV RNA检测
采用16次循环的CRT，偶联34次PCR，检测从50μl血清（或血浆）样品中制备的HCV RNA，并同时进行巢式PCR和普通RT－PCR（采用34次循环） 检测对照。 从电泳结果(图2)可以看出， CRT－PCR的检测灵敏度接近巢式PCR，高于普通的RT－PCR，而且CRT－PCR放大倍数适中，不象巢式PCR那样因为原始模板浓度高，容易出现非特异结果。在136例抗－HCV阳性血清中，用CRT－PCR法检出124例，说明绝大多数HCV抗体阳性者存在病毒的复制。未能检出HCV－RNA的病例，可能为既往感染的免疫反应，也有可能是病毒株的序列变异，使引物难以互补结合或HCV RNA低于PCR法的检测极限所致。从实验设计来说，后两种情况的可能性较小。54例HCV阴性血清中，仍有4例检出HCV－RNA，提示ELISA法不能检出全部HCV感染者。因为在HCV感染早期，患者血清中没有可检出的抗病毒抗体，抗体出现较晚，一般要在感染1～4.5个月左右才能出现。而HCV的复制出现得早，在感染后数天即出现病毒血症，因而 PCR可较早地检出HCV病毒的感染［5，7］。在总共163例巢式PCR检测为HCV RNA阳性的样品中，CRT－PCR检出161例，灵敏度为98.8％，远高于RT－PCR的60.8％。（表1）
图1 CRT－PCR及QC－PCR结果
Figure 1 Results of CRT-PCR and QC-PCR
(a) Ethidium bromide stained CRT-PCR products. Lines 1, 2, 4, 8, 16, and 32 indicate the numbers of CRT cycles (as RT-PCR, the number=1); M=DNA size marker (PCR-Markers, Sino-American Biotechnology Co.): 1,543, 994, 695, 515, 377, 237bp. The size of HCV RNA PCR product is 297bp. (b) Ethidium bromide stained QC-PCR products. The size of HCV RNA PCR product is 297 bp, and the size of QC-DNA PCR product is 454bp. (c) Plot of standard curve.
图2 HCV RNA PCR扩增结果对照
Figure 2 HCV RNA amplification by RT-PCR, CRT-PCR and nested-PCR
M=DNA size marker(PCR-Markers, Sino-American Biotechnology Co.): 1,543, 994, 695, 515, 377, 237 bp. The size of HCV RNA PCR product is 297 bp. 1. CRT-PCR; 2. rT-PCR; 3. nested-PCR.
表1 样品HCV RNA的检出率
Table 1 Detection of HCV RNA in the samples
| Kind of PCR | Detection of HCV RNA from 50μl of serum or plasma | |||||||||
| HCV antibody ELISA positive | HCV antibody ELISA negative | Clinical samples＊ | HCV RNA
totally positive rate | |||||||
| ＋ | － | HCV RNA
positive rate |
＋ | － | HCV RNA
positive rate |
＋ | － | HCV RNA
positive rate | ||
| CRT－PCR | 124 | 12 | 91.2 | 4 | 50 | 7.4 | 33 | 75 | 30.6 | 57.9％ |
| RT－PCR | 82 | 54 | 60.3 | 1 | 53 | 1.9 | 16 | 92 | 14.8 | 35.6％ |
| NT－PCR | 126 | 10 | 92.6 | 4 | 50 | 7.4 | 33 | 75 | 30.6 | 58.6％ |
＊ Results of liver function test were abnormal；＋，－：Indicating HCV RNA positive and negative respectively.讨 论
ELISA法和RT－PCR法检测的对象是不同的，ELISA法主要检测血清中有无HCV抗体的存在，而RT－PCR法主要检测有无HCV－RNA的存在。HCV抗体的存在表明患者受到过HCV的感染；而HCV－RNA的存在表明HCV基本上处于复制期，这时的患者具有传染性［5，7］。
RT－PCR逆转录反应合成的RNA－cDNA杂合双链在被高温变性之后，只有cDNA单链被用做PCR模板，虽然原先的RNA模板在反应体系中继续存在，但已经不起作用。这样没有充分利用RNA，不利于低丰度的RNA的检测和分析。我们在基因表达芯片研究过程中发现，利用FD耐热逆转录酶对mRNA进行CRT，可以得到最高40～50倍量（与常规RT相比）的长度在200～500bp之间的cDNA，在15～20个循环之前，RNA模板没有明显降解（具体数据略）。虽然CRT－PCR理论上的灵敏度无法与巢式PCR相比，但我们的结果表明，CRT－PCR对HCV RNA检测的灵敏度达到巢式PCR的98.8％。检测中我们选用16个循环的CRT，原因是：①这时体系中RNA模板没有明显降解，结果比较稳定；②更多循环的CRT对HCV检测灵敏度提高不大，且耗时长对实际应用不利。与巢式PCR比较，CRT－PCR具有以下优点：（1）技术设计简单，成本低；（2）便于实行定量PCR；（3）操作简便，发生污染的机会低，结果易判断。
定量PCR作为高灵敏度的定量检测方法，具有重要的临床价值［6］。标准曲线法是一种新出现的定量PCR方法，相对简单准确，适用的PCR循环数可以多达34次，甚至更多，提高了灵敏度［8，9］。但这种方法要求对RNA的样品作梯度稀释，不适于低丰度的RNA的检测分析，并且因为加大了RNA的耗费及被降解或污染的可能，会导致实验误差增大，甚至失败。而将CRT应用于定量PCR，由于CRT是线性增长过程，通过改变RT的循环数，可以得到定量PCR所需的起始模板量的变化，在减少甚至避免对RNA样品进行稀释的同时，还提高了分析的灵敏度，特别适合于比较珍贵的、低丰度的RNA样品的定量分析，这是对标准曲线法很大的改进和补充。我们将在以后的工作中对此作进一步的研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（批准号：39700082）
作者简介：陈燃（1970－），男，博士，讲师，现从事基因芯片技术及应用研究。
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