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聚合酶链反应法检测人类细小病毒B19DNA及相关片段克隆鉴定

来源:中华实验和临床病毒学杂志
摘要:对1997年1月至3月广东省肇庆市第一人民医院儿科住院病儿采取指端未梢血检测人类细小病毒B19。在所检测的42例患儿中,新生儿高胆红素血症15例,吸入综合征10例,硬肿症2例,颅内出血3例。上海科学技术出版社,1996)一书介绍的方法进行质粒DNA的制备、酶切和纯化。序列测定采用PBS质粒的通用引物T3、T7进行双链DNA测序,具......

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对1997年1月至3月广东省肇庆市第一人民医院儿科住院病儿采取指端未梢血检测人类细小病毒B19。在所检测的42例患儿中,新生儿高胆红素血症15例,吸入综合征10例,硬肿症2例,颅内出血3例;小儿肺炎7例,支气管炎3例,肠炎2例;其中男性25例,女性17例;年龄分布为新生儿20例,1个月到1岁10例,1岁至3岁5例,3岁至7岁6例,7岁至15岁1例。采取患儿末梢血100μl,加入等量Chelex煮沸10分钟,冷却至室温后离心10分钟,吸取上清做模板进行巢式PCR扩增。引物序列为:A1 5'-AATGAAAACTTTCCATTTAATGA-3',B1 5'-TCCTGAACTGGTCCCGGGGATGG-3;A2 5'-GCGTGGAAGTGTAGCTGTGCC-3',B2 5'-CAGAGCTTTCACCACCACTGC-3'。巢式PCR反应条件为:93℃1min;56℃45S;72℃20S,然后72℃8min,共计35个循环。第1次扩增用引物A1 B2;扩增完成后吸取5μl产物作为第2次PCR的模板。第2次扩增用的引物为A2 B2,扩增完成后取20μl产物行1%的琼脂糖凝胶电泳,出现355bp左右的片段时,初步视为阳性结果。然后得初步阳性结果的产物按《基因工程操作技术》(李德葆等编;上海科学技术出版社,1996)一书介绍的方法进行质粒DNA的制备、酶切和纯化。序列测定采用PBS质粒的通用引物T3、T7进行双链DNA测序,具体操作过程按Promega公司的Taq Track DNA Sequencing Kit操作说明进行。

  结果,在42例标本中共检测出4例阳性结果,其产物扩增片段长度为355bp左右,与文献报道相符。将产物克隆后片段进行酶切分析,所得片段长度亦为355bp左右。序列分折所得的DNA序列结果与国外文献(Shade R O,B/undell M C,Cotmore S,et al. J.Virol,1986,58:921)报道的结果完全一致,与基因库查询结果亦完全相同,由此可基本确定此DNA序列确为人类细小病毒B19的DNA序列,并可推论此4例患儿确实有人类细小病毒B19的感染。本研究所检出的4例阳性病例均为新生儿,是否新生儿较易感染此病毒并引发有关疾病由于病例较少,不易作出判断,尚有待进一步的研究。(本文基因克隆及序列分析由浙江医大董海涛老师指导完成,在此谨致谢意)


作者: 蔡定邦… 2009-2-21
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