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单位:程计林 仝文斌 高巍 冯百芳 (100044 北京医科大学人民医院肝病研究所);程巨才 (河南省焦作市化工总厂职工医院)
关键词: 丙型肝炎病毒;单个核细胞
【摘要】 目的 复制丙型肝炎病毒(HCV)感染的细胞模型。方法 用EB病毒感染其HCV阳性患者的外周血单个核细胞并使其转化,获得HCV的外周永生化B细胞株。以后,每隔1个月应用套式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测1次培养细胞和上清中的HCV RNA。结果 HCV可以在传代细胞中持续存在1年,培养细胞中的HCV负链和培养上清中的HCV则呈间断阳性。结论 HCV可以在该细胞株中较长时间存在、复制和分泌。
Establishment of hepatitis C virus reproductive model of human peripheral blood mononuclear cells transformed by Epstein-Barr virus
CHENG Jilin*, CHENG Jucai, TONG Wenbin, et al.
(Institute of Hepatology of People′s Hospital, Beijing 100044)
【Abstract】 Objective For the present, one of the crucial questions to study pathogenic mechanism of hepatitis C and its drug therapy is to seek a suitable cell model which may support the replication of hepatitis C virus(HCV). In this article, we made effort on the study of this aspect.Methods Using Epstein-Barr virus(EBV), we transformed the peripheral blood mononuclear cells(PBMC) isolated from a patient diagnosed as chronic hepatitis C. HCV RNA from the cultured cells and the supernatants were analysed by reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR) at an intervals of one month.Results HCV positive-strand RNA could be detected continually in the cultured cells for more than one year since the establishment of the transformed PBMC clone whereas the negative-strand RNA were also observed in the cultured cells. Interestingly, the HCV positive-strand RNA could be identified in supernatants intermittently.Conclusion HCV may exist in the cultured cell line for a longer period and reproduce in and secrete out of the cells. This will offer a new cell model for studying the molecular biology and immunology of HCV.
【Key words】 Hepatitis virus Mononuclear cells
近年来国内外学者通过液相RT-PCR和原位PCR研究发现,丙型肝炎病人外周血单个核细胞(PBMC)中存在丙型肝炎病毒(HCV),认为PBMC可能是HCV的潜伏感染库,是病毒复制的一个场所[1]。因此,若使命名丙型肝炎患者的PBMC在体外获得长期存活的能力,传代培养,则可能建立一个较为理想的丙型肝炎病毒复制模型。我们利用Epstein-Barr病毒(EB病毒)具有在体外可能使人B淋巴细胞感染,并能诱导淋巴细胞发生转化,转化的细胞可以无限地生长下去,即成为永生性细胞系的特性[2],对体外EB病毒转化的病人外周血单个核细胞中的丙型肝炎病毒复制现象进行了研究。
1 材料和方法
1.1 外周血单个核细胞的来源 取自慢性丙型肝炎、HCV抗体阳性、HCV RNA阳性、PBMC中HCV RNA阳性的病人(符合1995年5月第5次全国传染病及寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准)。
1.2 主要试剂 EB病毒来自B95-8细胞株,由中国预防医学科学院病毒所惠赠;淋巴细胞分离液为中国医学科学院血液研究所产品;RMPI-1640培养基购自Gibco公司;逆转录酶(AMV-RT)、dNTPs、RNasin、Taq-p均购于Promega公司。
1.3 外周血单个核细胞的分离及EB病毒的转化 收集病人新鲜肝素抗凝血8~10 ml,留取部分血清后加入等体积的磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)稀释。然后,分2等份分别缓缓加入到淋巴细胞分离液面上(稀释血液:分离液为2∶1),18 000 r/min,离心15 min。吸取PBMC,加入无胎牛血清的RMPI-1640培养液5 ml离心洗涤细胞3次,其中1管加入细胞冻存液-70℃冻存备用(待测PBMC中的HCV);另一管则加入20%胎牛血清RMPI- 1640培养液0.5 ml和EB病毒液0.5 ml(B95-8细胞培养液经0.45 nm滤膜过滤后,-70℃分存)。在37℃水浴摇床孵育2 h之后,以107细胞/ml浓度置96培养孔板中,37℃、5%CO2的孵箱中培养,每周半量换液1次,连续传代培养,获得永生细胞系,连续传代培养,获得HCV的外周血永生化B无限细胞系。然后,用96孔塑料培养板单细胞克隆法对永生细胞系细胞进行克隆细胞培养从而得到EB病毒转化的永生化PBMC传代细胞株(LCL)克隆细胞(图1)。换液时,取部分细胞,1 800 r/min, 离心5 min, 留取培养上清液后,用DEPC处理的PBS洗细胞10次,留取第10次洗液,然后,再用DEPC处理的PBS 200 μl制成细胞悬液。细胞培养上清、 洗液和细胞悬液均冻存于 -70℃备用。
图1 EB病毒转化的永生化PBMC传代细胞(LCL)
细胞呈现明显的广泛的细胞团状或簇状增殖生长。 ×400
Fig.1 Immortaliged cell line of human peripheral blood mononuclear cells transformed by Epstein-Barr virus(LCL)
The cells multiply and grow as cell regiments or clusters. ×400
1.4 HCV的检测 采用逆转录聚合酶链反应。引物选自HCV的5′-非编码区,分为外引物1(正链5′-CTGTGAGGAACTACTGTCTT-3′,核苷酸28~47)、2(负链5′-AACACTACTCGGCTAGCAGT-3′,核苷酸229~248)和内引物3(正链5′-TTCACGCAGAAAGCGTCTAG-3′,核苷酸46~65)、4(负链5′-GTTGATCCAAGAAAGGACCC-3′,核苷酸171~190)。检测正链用下游引物2(负链),检测负链用上游引物1(正链),逆转录42℃,60 min。第1次PCR,用上、下游引物1、2,94℃变性60 s, 60℃退火、延伸90 s, 35个循环;第2次PCR,用上、下游引物3、4,94℃变性60 s, 60℃退火、延伸90 s,30个循环。取第2次PCR产物10 μl6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,HCV正、负链产物大小均145 bp。为控制操作,防止污染,每次实验均设阳性和阴性对照。
2 结果
2.1 LCL的形态学特征 细胞体积增大,呈球状,胞浆丰富,细胞表面有毛、刺状伪足伸出,细胞核巨大,呈圆、椭圆和不规则型,染色质疏松,部分细胞胞浆和核仁散在存在许多空泡,细胞表现为明显的、广泛的团状或簇状增殖生长(图1,2)。
图2 LCL瑞氏染色
细胞体积增大,球状,细胞表面有毛、刺状伪足伸出,细胞核巨大不规则
Fig.2 Wright′s stain on LCL
The cell bodies are larger and resemble sphere. There are the pseudo-foot-like hairs or thorns on cell surfaces. The cell nuclei are huge and irregular
2.2 丙型肝炎病人血清、PBMC中的HCV RNA检测结果 HCV RNA均阳性,其第2次PCR产物片段为145 bp,见图3。
图3 丙型肝炎病人血清、PBMC中的HCV RNA RT-PCR电泳结果,142 bp为M第8条带。
1:阴性对照.2:最后1次洗PBMC液.3:HCV RNA阳性血清.4:丙型肝炎病人的PBMC.5:阳性对照.M:核酸分子量参照物.
Fig.3 Identification of HCV RNA in serum and PBMC, of the chronic hepatitis C patient with RT-PCR is 142 bp
1:Negative control. 2:The last wash of PBMC. 3:HCV RNA positive serum. 4:PBMC from gepatitis C patient. 5:Positive control. M:pGEM-72f(+)/HaeⅢ markers
2.3 LCL传代细胞和培养上清中HCV RNA正、负链检出情况 见表1。每月用套式RT-PCR检测1次,培养细胞中HCV RNA正链持续12个月阳性,而培养上清中则呈间断性阳性,无明显规律。阴性对照和最后1次洗培养细胞液均阴性,阳性对照阳性(图4)。传代细胞中负链HCVRNA间断出现,培养细胞上清阴性。阴性对照和最后1次洗培养细胞液均阴性,阳性对照阳性(图5)。
表1 EB病毒转化PBMC传代培养细胞和培养上清中HCV RNA正链和负链检测结果
Tab.1 Detection of HCV RNA positive-strand and negative-strand by RT-PCR in the EBV transformed PBMC and in the supernatants
培养时间 Incubation time (Months) | ||||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
HCV RNA正链
HCV-RNA positive strand | ||||||||||||
细胞
Cells |
+ | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
培养上清
Supernatants |
+ | - | - | + | + | - | - | - | + | - | + | - |
HCV RNA负链
HCV-RNA negative strand | ||||||||||||
细胞
Cells |
+ | - | - | + | - | - | + | - | + | - | - | + |
培养上清
Supernatants |
- | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
+:PCR阳性;-:PCR阴性
+:PCR positive. -:PCR negative
图4 HCV RNA正链RT-PCR电泳结果,142 bp为M第8条带。
1:培养细胞.2:培养上清.3:最后1次洗EBVTB液.4:阳性对照.5:阴性对照.M:核酸分子量参照物
fig.4 Identification of HCV RNA positive strand in the EBV transformed PBMC and the supernatants with RT-PCR, 8th band of the marker is 142 bp
1:EBVTB cells. 2:Supernatants. 3:The last wash of EBVTB. 4:Positive control. 5:Negative control. M:pGEM-72f(+)/HaeⅢ markers
图5 HCV RNA负链RT-PCR电泳结果
1:阴性对照.2:培养细胞.3:培养上清.4:最后1次洗EBVTB液.5:阳性对照.M:核酸分子量参照物
Fig.5 Identification of HC RNA negative strand in the EBV transformed PBMC and the supernatants with RT-PCR
1:Negative control. 2:EBVTB cells. 3:Supernatants. 4:The last wash of EBVTB. 5:Positive control. M:100 bp DNA ladder.
3 讨论
丙型肝炎病毒为单股正链RNA病毒,本身携带遗传信息,当它侵入宿主细胞后,即可通过RNA复制酶,以病毒RNA为模板,进行病毒RNA的复制。HCV不仅可能感染肝细胞,也可以侵入肝外多种组织和器官[3],尤其其亲淋巴细胞嗜性[4]正在引起越来越多的关注。已有研究发现,丙型肝炎病人的外周血单个核细胞中不仅有HCV RNA正链存在,也有负链存在,表明HCV可在PBMC中复制[5]。Nanvas等[6]发现,丙肝患者血清中的HCV RNA检出率为69%,而PBMC和肝组织中的检出率为100%;HCV RNA负链在病人的PBMC和肝组织的检出率分别为82%和95%,进一步证实肝脏和PBMC均可作为HCV RNA复制的场所。
应用EB病毒转化人外周血B细胞的技术已逐渐成熟[7],已知成熟的B细胞表面有补体片段受体CR1和CR2,其中CR2也是EB病毒的受体。当EB病毒在体外与B细胞膜上的CR2结合后可使B细胞母细胞化并生长为细胞株[8]。本研究成功地使HCV阳性丙肝患者的PBMC母细胞化,并传代培养。经1年RT-PCR反复检测发现,HCV可以在传代培养细胞中持续存在。同时,在传代细胞中间断发现HCV RNA负链,培养上清中间断发现HCV RNA正链。说明HCV不仅可以存在于PMBC,而且可以在EB病毒转化的无限B细胞系中随着传代细胞存活、复制并分泌出细胞外。这为EB病毒转化的无限B细胞系作为HCV复制模型提供了实验室和理论根据,也支持Ounanian等[9]的发现,慢性丙型肝炎的复发与患者体内PBMC中持续存在HCV感染有关。可见,丙肝病人PBMC母细胞化作为HCV复制模型与以往诸多HCV细胞模型有所不同,该模型中的HCV更接近于原体内感染者的感染状况。
美国中华医学会基金资助(CMB93582)和卫生部科研基金资助(98-1-269)
参考文献
1 Zignego A L, Carli DM, Monti M, et al. Hepatitis C virus infection of mononuclear cells from peripheral blood and liver infiltrates in chronically infected patients. J Med Virol, 1995, 47(1):58-64.
2 Buell GN, Reisman D, Kintner C, et al. Coloning overlaping DNA fragments from the B95-8 strain of Epstein-Barr virus reveals a site of homology to the internal repetition. J Virol, 1981, 40(3):977-982.
3 Stephanos J H. Nonhepatitis manifestation and combined diseases in HCV infection. Dig Dis Sci, 1996, 41(suppl):63 s-74 s.
4 Luppi M, Ferrarri MG, Bonaccorsi G, et al. Hepatitis C virus infection in subsets of neoplastic lymphoproliferations not associated with cryogrobulinemia. Leukemia, 1996, 10:351-355.
5 Zignego A L, Macchia D, Monti M, et al. Infection of peripheral blood mononuclear cells by hepatitis C virus. J Hepatol, 1992, 15:382-392.
6 Navas S, Castillo L, Bartolome J, et al. Positive and negative hepatitis C virus RNA strands in serum, liver and peripheral blood mononuclear cells in anti-HCV positive patients: relation with the liver lesion. J Hepatol, 1994,21:182-186.
7 Gras G, Racard Y, Raques P, et al. Complement and virus-specific antibody-dependent infection of normal B lymphocytes by human immunodeficiency virus type 1. Blood, 1993,81:1808-1816.
8 Moss D J. Assay of the infectivity of Epstein-Barr virus by transformation of human leukocytes in vitro. J Gen Virol, 1972, 17:233-239.
9 Ounanian A, Bueddah N, Rola-Chon A, et al. Hepatitis C virus RNA in plasma and blood mononuclear cells in patients with chronic hepatitis C treated with alpha-interferon. J Med Virol, 1995, 45:141-146.