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The chimeric BPVL1/HPV16E7 virus-like particles induced CTL
CHENG Hao, ZHENG Shu, LIU Xiao
(song, et al. Department of Dermatology, Sir Run Shaw Hospital of Zhejiang University, Hangzhou 310016, P.R. China)
【 Abstract 】 Objective To study the immunogenesis of chimeric BPVL1/HPV16E7 virus-like particles (VLPs).Methods The in vitro cytotoxic T lymphocyte (CTL) assay was applied to characterize the antigen presenting procedure of this chimeric VLPs in EL-4 cell.Results The chimeric VLPs could be processed in EL-4 cells which then induced specific cell lysis by CTL. The antibody against L1-VLPs blocked the specific cell lysis.Conclusion The chimeric BPVL1/HPV16E7 VLPs, were endocytosed after binding to its receptor on EL-4 cell membrane, and then transported, digested, and presented CTL epitope. As a result, the specific cellular immunity was induced in vitro. The results suggested a potentiality of utilizing HPV16E7 as a vaccine.
【 Subject words 】 HPV16E7; Virus-like particles; Cytotoxic T lymphocyte
人类乳头状瘤病毒(HPV)16型早期蛋白E7被证实不仅对细胞恶性转化和维持恶性过程起着关键作用〔1,2〕，而且还是肿瘤排斥抗原〔3〕。因此，阻止肿瘤形成的E7疫苗已成为近年研究热点。本实验使表达和纯化的含晚期结构基因和早期基因的BPVL1/HPV16E7嵌合型病毒样颗粒VLPs作为抗原在EL-4细胞得到呈递，并引发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。
材料和方法
细胞、菌株、质粒、试剂和动物：EL-4细胞（小鼠胸腺瘤细胞株）、C2细胞(HPV16E7基因转染的EL-4细胞)、大肠杆菌DH5α、昆虫细胞(Sf9)、质粒pUC(含有BPVL1)、质粒pVL1393、HPV16晚期结构基因L1单抗(MC15)以及HPV16E7(a)和(b)单抗等均由澳大利亚昆士兰大学免疫和癌症研究中心(CICR)提供。EL-4细胞和C2细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。Sf9细胞的培养基为含10%胎牛血清的Sf-900Ⅱ培养基(GIBCO, BRL, USA)。杆状病毒和Baculo GoldTM转染药盒购于美国Pharmingen公司。EcoRⅤ、BamHⅠ、XbaⅠ、NgoMⅠ、T4 DNA连接酶和限制性内切酶缓冲液等购于美国Promega公司。DNA提取药盒购于美国QIAGEN公司。增强化学发光法(enhanced chemiluminescence, ECL)药盒购于澳大利亚Amersham公司。雌性4～6周龄小鼠C57BL/6J由澳大利亚动物资源中心提供。
BPVL1/HPV16E7重组体的构建、表达和纯化鉴定：参照文献〔4,5〕。
聚合酶链反应(PCR)：HPV16E7基因被分成3段进行PCR扩增。3对引物分别为：E7(a), 5′-ATG
GATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC-3′和5′-C
ATGGATATCCGGCCGTTATGAGCTGTCATTTAATTGC-3′；E7(b), 5′-TATGGATATCGAGGAGGAGGATGATGAA
ATAGATGGTCC-3′和5′-CATGGATATCCGGCCGTTACC
TAGAGTCACACTTGCAACAAAAGG-3′；E7(c), 5′-ATG
GATATCCTTCGGTTGTGCGTACAAAGC-3′和5′-GATAT
CCGGCCGTTATGGTTTCTGAGACCAGA-3′。
基因克隆：乳头状瘤病毒的晚期结构基因L1的C末端不为形成病毒样颗粒所必须，而可切除部分片段并融合其它基因片段，其表达的重组蛋白也并不因此而降低其形成VLPs的能力。利用此特性我们将3段HPV16E7(a)、E7(b)和E7(c)的PCR扩增产物经EcoRⅤ酶切后克隆入连接有BPVL1的载体pUC，并用XbaⅠ和NgoMⅠ酶切筛选正确连接克隆。将3段BPV L1-HPV16E7分别经BamHⅠ酶切后插入杆状病毒转染质粒pVL1393(图1)，XbaⅠ酶切筛选正确连接克隆。3株重组克隆分别命名为pVL1393/BPV L1-HPV16E7(a)、pVL1393/BPV L1-HPV16E7(b)和pVL1393/BPV L1-HPV16E7(c)。
图1 构建pVL1393-BPVL1/HPV16E7的转染质粒示意图
Fig 1. Construction of pVL1393-BPVL1/HPV16E7 transfer vector
转染杆状病毒：用Baculo GoldTM转染药盒将pVL1393/BPVL1-HPV16E7转染杆状病毒线状DNA并感染Sf9的昆虫细胞，27℃培养约72 h即生成VLPs。
重组杆状病毒的表达和纯化：上述昆虫细胞培养液经离心、沉淀重悬于PMSF-PBS、冰浴上匀浆器碾磨、超声裂解、20%蔗糖及5%氯化铯4℃超离心、收集浮密度为1.30g/ml的白色条带(含重组蛋白VLPs)。
重组蛋白的鉴定：重组蛋白经10% SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色和Western blot分析。后者转膜后用BPVL1单抗MC15(1∶2 000)和HPV16E7单抗(1∶1 000)杂交、ECL法显示杂交条带。另将样本进行透射电镜观察。
CTL反应
靶细胞的标记：靶细胞为C2细胞和EL-4细胞2种。加100μCi 51Cr标记细胞。
效应细胞的制备：在C57 BL/6J小鼠尾根部免疫接种100μg的HPV16E7寡肽(RAHYNIFTF，HPV16E7第49～57位氨基酸）。21 d后取接种鼠脾细胞并同时取裸鼠脾细胞作为抗原呈递细胞(APC)；培养第4～7天作为效应细胞用于CTL测定。
用VLPs刺激靶细胞：3种嵌合型BPVL1-HPV16E7 (a)、(b)和(c) VLPs分别与上述51Cr标记的C2细胞和EL-4细胞孵育3 h（浓度为50μg VLPs/106细胞）。作为对照将靶细胞与BPV1L1-VLPs抗体(1∶1 000)和无关抗体(抗兔抗体1∶1 000)孵育1 h后再与3种嵌合型 VLPs孵育3 h。
CTL反应测定：分别加100μl效应细胞和靶细胞于圆底96孔板，效应细胞/靶细胞比例(E∶T ratio)调至5∶1、2.5∶1、0.1∶1，每份样本重复3孔；37℃ 5%CO2孵育5 h后每孔收集100μl上清液；γ计数仪测定同位素释放量。靶细胞的特异性溶解百分率计算如下：
最大释放量为100μl靶细胞中加入100μl的10% SDS后的同位素释放量，自发释放量则为100μl靶细胞与100μl培养基孵育而得。
结果
1.含BPVL1/HPV16E7的VLPs的生成和鉴定：本实验成功克隆和表达了3段含BPVL1/HPV16E7(a)、(b)和(c)的嵌合型VLPs。在氯化铯梯度液中收得浮密度为1.30g/ml的可见条带，经SDS-PAGE分离后用考马斯亮蓝染色和Western blot证实，相对分子质量(Mr)为55×103附近的条带均为特异的L1及HPV16E7(a)和(b)(图2)。透射电镜证实3种嵌合型VLPs均为形态和结构与野生型乳头状瘤病毒相同的50nm大小的环状颗粒结构(图3)。我们未能用E7(c)抗体鉴定BPVL1/HPV16E7(c)，但根据酶切、Western blot、考马斯亮蓝染色和电镜结果我们推断得到了BPVL1/HPV16E7(c)。
2.嵌合型VLPs引发的体外CTL反应：与3种嵌合型BPV1L1/HPV16E7(a)、(b)和(c) VLPs分别孵育的靶细胞被效应细胞特异性溶解的情况见图4。与BPV1L1/HPV16E7 VLPs (b)孵育的EL-4细胞能被效应细胞特异杀伤，其特异性溶解率分别为43.1%(E∶T=5∶1)、7.5%(E∶T=2.5∶1)和4.5%(E∶T=0.1∶1)。BPV1L1/HPV16E7 VLPs (a)和(c)未能有效引发特异性细胞溶解反应。未接受VLPs刺激的EL-4细胞未能被效应细胞有效杀伤。C2细胞用作CTL测定的阳性对照，其特异性溶解率为91.3%(E∶T=5∶1)、52.4%(E∶T=2.5∶1)和25.1%(E∶T=0.1∶1)。与BPV1L1-VLPs抗体孵育1 h后再与3种嵌合型VLPs孵育的EL-4细胞不能被效应细胞有效杀伤。用无关抗体处理的EL-4细胞与 BPV1L1/HPV16E7 VLPs (b)孵育后其特异性溶解率仍有42.3% (E∶T=5∶1)、6.5%(E∶T=2.5∶1)、5.6%(E∶T=0.1∶1)。
图2 Western blot嵌合型VLP用L1抗体杂交的ECL结果
Fig 2. BPVL1/HPV16E7 VLP Western blot probed with anti-BPVL1 developed with ECL
1: BPVL1/HPV16E7c; 2: BPVL1/HPV16E7b; 3: BPVL1/HPV16E7a; 4:BPVL1
图3 含HPV16E7的嵌合型VLP电镜照片
Fig 3. Electron micrography of chimeric BPVL1/HPV16E7 VLPs
图4 嵌合型VLP的CTL反应(E∶T=5∶1)
Fig 4. CTL responses induced by chimeric VLPs(E∶T=5∶1)
A,B and C: The specific lysis of EL-4 cells pulsed with chimeric VLPs (a), (b) and (c) respectively; D,E and F: The specific lysis of EL-4 cells pulsed both with anti-VLPs antibody and VLPs(a), (b) and (c) respectively; G: C-2 cells
讨论
我们利用HPV16晚期结构基因L1能连接50个氨基酸仍保留衣壳空间构象和抗原性而形成与野生型病毒极为相似的VLPs的这一特性将HPV16E7分段与L1连接，使其表达含HPV16E7的嵌合型VLPs，并用CTL反应对该种嵌合型VLPs的体外抗原呈递过程进行观察。以了解该嵌合型VLPs作为HPV疫苗的潜在可行性。
体外CTL反应能识别与含L1/HPV16E7 (b)嵌合型VLPs孵育过的靶细胞EL-4细胞。推测外源性含L1/HPV16E7(b)段的重组或称嵌合型VLPs能被MHCⅠ途径呈递。至于HPV16E7(a)和(c)的嵌合型VLPs不能有效引发CTL反应，主要因为所用效应细胞不能识别它们呈递的抗原信息。L1抗体能阻断该VLPs刺激的靶细胞的特异性溶解意味着该抗体能阻断抗原呈递，表明该嵌合型VLPs是与细胞表面受体相互作用后才被内吞和在细胞内进一步被处理。有可能该嵌合型VLPs作为抗原输送系统诱导宿主产生体液和细胞免疫反应。
参考文献
1，zur Hausen H. Human papillomaviruses in the pathogenesis of anogenital cancer. Virology, 1991, 184:9-13.
2，Lambert PF, Pan H, Pitot HC, et al. Epidermal cancer associated with expression of human papillomavrus type 16 E6 and E7 oncogenes in the skin of transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90:5583-5587.
3，Chen LP, Thomas EK, Hu SL, et al. Human papillomavirus type 16 nucleoprotein E7 is a tumor rejection antigen. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:110-114.
4，Peng SW, Frazer IH, Germain J, et al. Papillomavirus virus-like particles can deliver defined CTL epitopes to the MHC class I pathway. Virology, 1998, 240:147-157.
5，Qi YM, Peng SW, Hengst K, et al. Epithelial cells display separate receptors for papillomavirus VLPs and for soluble L1 capsid protein. Virology, 1996, 216(1):35-45.