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血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎的病原学研究

来源:中华微生物学和免疫学杂志
摘要:【摘要】目的对血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎进行病原学研究。方法用HBVPCR、HCVRT-PCR和HEVRT-PCR分别检测血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎患者血清,并对其部分阳性产物进行克隆测序。结果87例非甲~戊型肝炎血清HBVDNA均为阴性,9例(10。3%)为HCVRNA阳性,部分经测序证实为HCV1b亚型。...

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【 摘要 】 目的 对血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎进行病原学研究。方法 用HBV PCR、HCV RT-PCR和HEV RT-PCR分别检测血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎患者血清,并对其部分阳性产物进行克隆测序。结果 87例非甲~戊型肝炎血清HBV DNA均为阴性,9例(10.3%)为HCV RNA 阳性,部分经测序证实为HCV 1b亚型;余78例为HBV DNA和HCV RNA均阴性。该78例中,14例因无血清未作HEV RNA检测,余64例中49例(76.6%)为HEV RNA阴性,15例(23.4%)为HEV RNA 阳性。经序列分析显示,其中9例为典型的中国HEV株基因序列,6例变异较大,与典型的中国株基因序列的同源性仅为80%左右。49例HBV DNA、HCV RNA 和HEV RNA均阴性的血清中16例(32.6%)HGV RNA阳性。由此可见,该87例中至少有9例为HCV感染,15例为HEV感染,16例为HGV感染。结论 对血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎的病人应该用PCR法进行病原学分型,以明确其诊断。

  Studies on the etiology of patients with serologically negative non A~E hepatitis WANG Youchun,ZHUANG Hui,ZHANG Huayuan, et al.National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050

  【 Abstract 】 Objective To study the etiology of serologically negative non A~E hepatitis .Methods The sera from serologically negative non A~E hepatitis patients were tested for HBV DNA,HCV RNA, HEV RNA and HGV RNA with PCR method and some PCR positive products were cloned and sequenced.Results Nine of them (10.3%) were positive for HCV RNA. 64 sera with negative HBV DNA and HCV RNA were tested for HEV RNA.15 of them(23.4%)were HEV RNA positive. Nine of the 15 HEV sequences have 95% homology and the remaining 6 have only 80% homology as compared with the Chinese HEV strain at the nucleotide level. Of 49 sera negative for HBV DNA,HCV RNA and HEV RNA, 16 were HGV RNA positive (32.6%) by RT-nPCR suggesting that the patients were infected with HGV.Conclusion The data suggest that the patients with serologically negative non A~E hepatitis have a different etiology and should be tested by PCR to identify the disease.

  【 Subject words 】 Hepatitis B virus   Hepatitis C virus  Hepatitis E virus  Hepatitis G virus  non-A-E hepatitis

  国内外文献报道,在急性散发性病毒性肝炎中,非甲~戊型肝炎约有(10~20)%。为探讨非甲~戊型肝炎的病原,我们对87例血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎进行了病原学研究,现将结果报告如下:

  材料与方法

  1.血清:87例血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎患者血清为中国医科大学附属第二医院、广西自治区卫生防疫站、北京佑安医院和河南省医学科学院肝病研究所提供。该87例非甲~戊型肝炎均为抗-HAV IgM, HBsAg, 抗-HBc IgM, 抗-HCV,抗-HEV阴性,所有血清均置-20℃冻存备检。

  2.HBV DNA和HCV RNA的检测:均用华美生物工程公司的PCR试剂盒严格按照说明书进行操作并判断结果。

  3.HEV RNA的检测:HEV RNA的提取、反转录以及基因扩增的方法及程序均与HGV RNA相同。HEV ORF2和 HEV ORF1的PCR引物为简并引物,由英国皇家免费医院医学院提供。

  ORF1外引物:5'-CTGGCATYACTACTGCYATTGAGC-3';5'-CCATCRARRCAGTAAGTGCGGTC-3'。

  ORF1内引物:5'-CTGCCYTKGCGAATGCTGTGG-3';5'-GGCAGWRTACCARCGCTGAACATC-3'。

  ORF2外引物:5'-GACAGAATTRATTTCGTCGGCTGG-3';5'-CTTGTTCRTGYTGGTTRTCATAATC-3'。

  ORF2内引物:5'-GTYGTCTCRGCCAATGGCGAGC-3';5'-GTTCRTGYTGGTTRTCATAATCCTG-3'。

  (注:Y为C或T;R为A或G;K为G或T;W为A或C)

  AMV逆转录酶和Taq聚合酶均为Promega公司产品。

  4.HGV RNA的检测:方法见参考文献〔2~4〕。

  5.HCV、HEV和HGV PCR阳性产物的克隆测序:见参考文献〔4,5〕。

  结 果

  1.HBV DNA检测:对87份非甲~戊型肝病患者的血清进行HBV DNA检测,结果均为阴性。

  2.HCV RNA检测和1份阳性产物的克隆测序:对87份非甲~戊型肝病患者的血清进行HCV RNA的检测,其中9份(10.3%)为HCV RNA阳性。但用Abbott抗-HCV酶联免疫试剂(EIA)对该9份HCV RNA阳性血清再次检测抗-HCV,结果为阴性。对其中1例PCR阳性产物(HN1)进行纯化,并克隆到pGEM4 T easy 质粒中进行测序,发现该株HCV与1b亚型的核苷酸序列的同源性为99.1%,说明该株病毒为典型的中国株(见图1)。

  图1 从1名血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎病人血清中分离的 HCV 5'非编码区的核苷酸序列〔6〕

  Fig 1. Nucleic acid sequence of HCV 5'-noncoding region isolated from the serum of a patient with serologically negative non A-E hepatitis

  3.HEV RNA检测和阳性产物的克隆测序

  (1) ORF1和ORF2 PCR引物检测结果:用ORF2引物检测64例非甲~戊型肝病患者的血清,其中有14例为HEV RNA阳性;从该64例非甲~戊型肝病患者的血清中随机抽取28例,用ORF1引物进行RT-PCR检测,结果有6例为RNA阳性;而在该28例中有13例为ORF2引物检测阳性。由此可见,ORF2的检出率明显高于ORF1的引物(见表1),但由于ORF2引物高度简并,带型较模糊,所有可疑阳性均需测序证实。

  表1 ORF1和ORF2引物检测结果

  Table 1.Comparison of PCR results with ORF1 and ORF2

Cases HEV ORF1 HEV ORF2
 5 + +
 1 + -
 8 - +
14 - -

  (2)阳性产物的克隆测序:对ORF1引物所测的PCR阳性或可疑阳性产物进行纯化,克隆到pCRIIT载体上,并进行测序。用该引物所得到的6条PCR产物序列中,有5条与典型的中国株基因序列的同源型超过95%,只有1株属于变异株;对ORF2引物所测的10例PCR阳性产物按与ORF2同样的方法进行测序,所得到的10条PCR产物序列中,有6条为变异株,与典型的中国HEV株的基因序列同源性只有80%左右(见图2和图3)。

  图2 从血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎病人血清中分离的 HEV ORF1的部分基因序列

  Fig 2.Nucleic acid sequences of HEV ORF1 isolated from the sera of patients with serologically negative non A-E hepatitis

  图3 从血清学标志阴性非甲~戊型肝炎病人血清中分离的 HEV ORF2的基因序列

  Fig 3.Nucleic acid sequences of HEV ORF2 isolated from the sera of patients with serologically negative non A-E hepatitis

  (3) 肝炎的不同临床类型中HEV RNA的检测:在64例非甲~戊型肝病患者的血清中,14例临床诊断为慢性肝炎,50例诊断为急性肝炎,其中14例慢性肝炎中无一例为HEV RNA阳性;而50例急性肝病中,有15例为HEV RNA阳性。

  (4)基因分析:用GCG Wisconsin软件包对6株HEV ORF1和10株ORF2的基因序列进行基因族系分析(见图4,5)。从HEV ORF1基因进化图(图4)可见,S13、B1、B2、B6与印度和中国株关系较近;而S15与印度和中国株关系较远,表明是一种新的基因型。从HEV ORF2基因进化图(图5)可见,S1、S10、S11和H8与印度和中国株关系较近;而S5、S9、S15、H3、B3和B4与印度和中国株关系较远,但该6株进化关系较近,表明该6株是一种新的基因型。

  图4 HEV ORF1的基因进化图

  Fig 4.Phylogenetic tree based on partial nucleotide sequence of HEV ORF1

  India 1:X99441;India 2:X98292;China 1:L08816; China 2:L25595;China 3:D11091;Pakistan: M80581;Burma: M73218; Mexico:M74506

图5 HEV ORF2的基因进化图

  Fig 5.Phylogenetic tree based on partial nucleotide sequence of HEV ORF2

  India 1:X99441;India 2:X98292;China 1:L08816; China 2:L25595;China 3:D11091;Pakistan: M80581;Burma: M73218; Mexico:M74506

  4.GBV-C/HGV RNA检测:49例HBV DNA、HCV RNA和HEV RNA阴性的非甲~戊型肝病患者的血清,再用RT-nPCR检测HGV RNA,结果16例为HGV RNA阳性,阳性率为32.6%。其中部分阳性产物经测序证实为HGV RNA。

  讨 论

  在87例血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎患者中,9例(10.3%)为HCV RNA 阳性,对其中1例阳性产物(HN1)进行测序证实为HCV 1b,因此,可诊断为丙肝,这可能是HCV感染的早期,抗-HCV抗体尚未出现,属HCV感染的“窗口”期。我国临床上一般以抗-HCV阳性作为诊断丙肝的标准,可能会漏诊部分丙肝患者。

  在64例HBV DNA和HCV RNA均阴性的非甲~戊型肝炎血清中,15例(23.4%)为HEV RNA 阳性。通过对该15例的HEV RNA阳性产物的序列分析显示,9例为典型的中国株HEV基因序列,这可能为HEV感染的早期,尚未出现抗-HEV抗体。另6例变异较大,与典型的中国株和墨西哥株基因序列的同源性仅为80%左右,可能为新的HEV亚型。通过对ORF1和ORF2简并引物的PCR产物测序分析表明,用ORF1引物所得到的基因序列大部分为典型的中国株序列,而ORF2引物所得到的基因序列大部分为变异株的序列,ORF1引物检测典型的HEV株较为敏感,而ORF2引物检测变异的HEV株较为敏感。因此,该HEV变异株不易被常规的HEV RNA RT-PCR法检出,临床上出现漏诊,至于现行的抗-HEV EIA能否检测到该变异株尚需进一步研究。

  对49例HBV DNA、HCV RNA和HEV RNA均阴性的非甲~戊型肝炎患者血清,用RT-nPCR检测HGV RNA,结果16例为HGV RNA阳性,阳性率为32.6%。其中部分阳性产物经测序证实为HGV RNA;而在HBsAg和抗-HCV均阳性的健康献浆血员中HGV RNA的阳性率为46%〔2〕,因此,HGV是否可引起临床型肝炎仍需进一步研究。

  本研究表明,目前临床上诊断的血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎的病原可能是多种多样的,必须进行深入的病原学分析,以便作出正确的诊断。

  此课题部分由英国Wellcome Trust基金资助

  参考文献

  [1]Buti M,Jardi R,Rodriguez-Frias F,et al. Etiology of acute sporadic hepatitis in Spain. Journal of Hepatology, 1994,20∶589-591.

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  [3]王佑春,庄辉,李河民,等. 我国献浆血员中庚型肝炎病毒(HGV)RNA的检测及部分序列分析. 中国公共卫生学报,1997, 5(16) ∶257-258.

  [4]王佑春,庄辉,李河民,等.我国部分地区庚型肝炎病毒(HGV)5端部分基因序列的比较.中国公共卫生,1997, 13(10)∶586-587.

  [5]王佑春,A Morris, TJ Harrison,等.庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C) NS3区基因序列的多变性.中华微生物学和免疫学杂志,1997,2(17)∶96-98.

  [6]安文锋,朱万孚,王淑萍,等.丙型肝炎病毒血清学分型与基因分型研究.中华微生物学和免疫学杂志,1997, 2(17)∶88-91.


作者: 王佑春… 2009-2-21
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