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Studies on the etiology of patients with serologically negative non A~E hepatitis WANG Youchun,ZHUANG Hui,ZHANG Huayuan, et al.National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050
【 Abstract 】 Objective To study the etiology of serologically negative non A~E hepatitis .Methods The sera from serologically negative non A~E hepatitis patients were tested for HBV DNA,HCV RNA, HEV RNA and HGV RNA with PCR method and some PCR positive products were cloned and sequenced.Results Nine of them (10.3%) were positive for HCV RNA. 64 sera with negative HBV DNA and HCV RNA were tested for HEV RNA.15 of them(23.4%)were HEV RNA positive. Nine of the 15 HEV sequences have 95% homology and the remaining 6 have only 80% homology as compared with the Chinese HEV strain at the nucleotide level. Of 49 sera negative for HBV DNA,HCV RNA and HEV RNA, 16 were HGV RNA positive (32.6%) by RT-nPCR suggesting that the patients were infected with HGV.Conclusion The data suggest that the patients with serologically negative non A~E hepatitis have a different etiology and should be tested by PCR to identify the disease.
【 Subject words 】 Hepatitis B virus Hepatitis C virus Hepatitis E virus Hepatitis G virus non-A-E hepatitis
国内外文献报道,在急性散发性病毒性肝炎中,非甲~戊型肝炎约有(10~20)%。为探讨非甲~戊型肝炎的病原,我们对87例血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎进行了病原学研究,现将结果报告如下:
材料与方法
1.血清:87例血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎患者血清为中国医科大学附属第二医院、广西自治区卫生防疫站、北京佑安医院和河南省医学科学院肝病研究所提供。该87例非甲~戊型肝炎均为抗-HAV IgM, HBsAg, 抗-HBc IgM, 抗-HCV,抗-HEV阴性,所有血清均置-20℃冻存备检。
2.HBV DNA和HCV RNA的检测:均用华美生物工程公司的PCR试剂盒严格按照说明书进行操作并判断结果。
3.HEV RNA的检测:HEV RNA的提取、反转录以及基因扩增的方法及程序均与HGV RNA相同。HEV ORF2和 HEV ORF1的PCR引物为简并引物,由英国皇家免费医院医学院提供。
ORF1外引物:5'-CTGGCATYACTACTGCYATTGAGC-3';5'-CCATCRARRCAGTAAGTGCGGTC-3'。
ORF1内引物:5'-CTGCCYTKGCGAATGCTGTGG-3';5'-GGCAGWRTACCARCGCTGAACATC-3'。
ORF2外引物:5'-GACAGAATTRATTTCGTCGGCTGG-3';5'-CTTGTTCRTGYTGGTTRTCATAATC-3'。
ORF2内引物:5'-GTYGTCTCRGCCAATGGCGAGC-3';5'-GTTCRTGYTGGTTRTCATAATCCTG-3'。
(注:Y为C或T;R为A或G;K为G或T;W为A或C)
AMV逆转录酶和Taq聚合酶均为Promega公司产品。
4.HGV RNA的检测:方法见参考文献〔2~4〕。
5.HCV、HEV和HGV PCR阳性产物的克隆测序:见参考文献〔4,5〕。
结 果
1.HBV DNA检测:对87份非甲~戊型肝病患者的血清进行HBV DNA检测,结果均为阴性。
2.HCV RNA检测和1份阳性产物的克隆测序:对87份非甲~戊型肝病患者的血清进行HCV RNA的检测,其中9份(10.3%)为HCV RNA阳性。但用Abbott抗-HCV酶联免疫试剂(EIA)对该9份HCV RNA阳性血清再次检测抗-HCV,结果为阴性。对其中1例PCR阳性产物(HN1)进行纯化,并克隆到pGEM4 T easy 质粒中进行测序,发现该株HCV与1b亚型的核苷酸序列的同源性为99.1%,说明该株病毒为典型的中国株(见图1)。
图1 从1名血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎病人血清中分离的 HCV 5'非编码区的核苷酸序列〔6〕
Fig 1. Nucleic acid sequence of HCV 5'-noncoding region isolated from the serum of a patient with serologically negative non A-E hepatitis
3.HEV RNA检测和阳性产物的克隆测序
(1) ORF1和ORF2 PCR引物检测结果:用ORF2引物检测64例非甲~戊型肝病患者的血清,其中有14例为HEV RNA阳性;从该64例非甲~戊型肝病患者的血清中随机抽取28例,用ORF1引物进行RT-PCR检测,结果有6例为RNA阳性;而在该28例中有13例为ORF2引物检测阳性。由此可见,ORF2的检出率明显高于ORF1的引物(见表1),但由于ORF2引物高度简并,带型较模糊,所有可疑阳性均需测序证实。
表1 ORF1和ORF2引物检测结果
Table 1.Comparison of PCR results with ORF1 and ORF2
Cases | HEV ORF1 | HEV ORF2 |
5 | + | + |
1 | + | - |
8 | - | + |
14 | - | - |
(2)阳性产物的克隆测序:对ORF1引物所测的PCR阳性或可疑阳性产物进行纯化,克隆到pCRIIT载体上,并进行测序。用该引物所得到的6条PCR产物序列中,有5条与典型的中国株基因序列的同源型超过95%,只有1株属于变异株;对ORF2引物所测的10例PCR阳性产物按与ORF2同样的方法进行测序,所得到的10条PCR产物序列中,有6条为变异株,与典型的中国HEV株的基因序列同源性只有80%左右(见图2和图3)。
图2 从血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎病人血清中分离的 HEV ORF1的部分基因序列
Fig 2.Nucleic acid sequences of HEV ORF1 isolated from the sera of patients with serologically negative non A-E hepatitis
图3 从血清学标志阴性非甲~戊型肝炎病人血清中分离的 HEV ORF2的基因序列
Fig 3.Nucleic acid sequences of HEV ORF2 isolated from the sera of patients with serologically negative non A-E hepatitis
(3) 肝炎的不同临床类型中HEV RNA的检测:在64例非甲~戊型肝病患者的血清中,14例临床诊断为慢性肝炎,50例诊断为急性肝炎,其中14例慢性肝炎中无一例为HEV RNA阳性;而50例急性肝病中,有15例为HEV RNA阳性。
(4)基因分析:用GCG Wisconsin软件包对6株HEV ORF1和10株ORF2的基因序列进行基因族系分析(见图4,5)。从HEV ORF1基因进化图(图4)可见,S13、B1、B2、B6与印度和中国株关系较近;而S15与印度和中国株关系较远,表明是一种新的基因型。从HEV ORF2基因进化图(图5)可见,S1、S10、S11和H8与印度和中国株关系较近;而S5、S9、S15、H3、B3和B4与印度和中国株关系较远,但该6株进化关系较近,表明该6株是一种新的基因型。
图4 HEV ORF1的基因进化图
Fig 4.Phylogenetic tree based on partial nucleotide sequence of HEV ORF1
India 1:X99441;India 2:X98292;China 1:L08816; China 2:L25595;China 3:D11091;Pakistan: M80581;Burma: M73218; Mexico:M74506
图5 HEV ORF2的基因进化图
Fig 5.Phylogenetic tree based on partial nucleotide sequence of HEV ORF2
India 1:X99441;India 2:X98292;China 1:L08816; China 2:L25595;China 3:D11091;Pakistan: M80581;Burma: M73218; Mexico:M74506
4.GBV-C/HGV RNA检测:49例HBV DNA、HCV RNA和HEV RNA阴性的非甲~戊型肝病患者的血清,再用RT-nPCR检测HGV RNA,结果16例为HGV RNA阳性,阳性率为32.6%。其中部分阳性产物经测序证实为HGV RNA。
讨 论
在87例血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎患者中,9例(10.3%)为HCV RNA 阳性,对其中1例阳性产物(HN1)进行测序证实为HCV 1b,因此,可诊断为丙肝,这可能是HCV感染的早期,抗-HCV抗体尚未出现,属HCV感染的“窗口”期。我国临床上一般以抗-HCV阳性作为诊断丙肝的标准,可能会漏诊部分丙肝患者。
在64例HBV DNA和HCV RNA均阴性的非甲~戊型肝炎血清中,15例(23.4%)为HEV RNA 阳性。通过对该15例的HEV RNA阳性产物的序列分析显示,9例为典型的中国株HEV基因序列,这可能为HEV感染的早期,尚未出现抗-HEV抗体。另6例变异较大,与典型的中国株和墨西哥株基因序列的同源性仅为80%左右,可能为新的HEV亚型。通过对ORF1和ORF2简并引物的PCR产物测序分析表明,用ORF1引物所得到的基因序列大部分为典型的中国株序列,而ORF2引物所得到的基因序列大部分为变异株的序列,ORF1引物检测典型的HEV株较为敏感,而ORF2引物检测变异的HEV株较为敏感。因此,该HEV变异株不易被常规的HEV RNA RT-PCR法检出,临床上出现漏诊,至于现行的抗-HEV EIA能否检测到该变异株尚需进一步研究。
对49例HBV DNA、HCV RNA和HEV RNA均阴性的非甲~戊型肝炎患者血清,用RT-nPCR检测HGV RNA,结果16例为HGV RNA阳性,阳性率为32.6%。其中部分阳性产物经测序证实为HGV RNA;而在HBsAg和抗-HCV均阳性的健康献浆血员中HGV RNA的阳性率为46%〔2〕,因此,HGV是否可引起临床型肝炎仍需进一步研究。
本研究表明,目前临床上诊断的血清学标志阴性的非甲~戊型肝炎的病原可能是多种多样的,必须进行深入的病原学分析,以便作出正确的诊断。
此课题部分由英国Wellcome Trust基金资助
参考文献
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