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关键词: 基因，病毒；聚合酶链反应；碱基序列；TTV
【摘要】 目的 克隆和测定北京地区TT病毒(TTV)分离株全基因序列。方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术从1例临床非甲～庚型肝炎病人血清中分段扩增TTV全基因，获得5个互相重叠的片段，分别长199 bp(1-199)，1 267bp(90-1 356)，878 bp(1 354-2 231)，1 129 bp(2 178-3 306)，434 bp(3 306-3 739)，用标准的分子生物学方法测定了这5个序列，从而得到全长TTV基因序列。结果 北京地区TTV分离株全基因长3 739个核苷酸，含2个开放读码框架(ORF)。第1个ORF位于589至2 902位核苷酸，编码770个氨基酸，第2个ORF位于107至715位核苷酸，编码202个氨基酸。TTV基因的5′和3′末端为非编码区，分别有106和837个核苷酸。在该基因中A占31.2%，C占25.4%，G占22.5%，T占20.9%。北京地区TTV分离株与日本分离株的核苷酸和氨基酸同源性均在95%以上。结论 北京地区TTV分离株和日本株属同一基因型。
Cloning and sequencing of complete TT virus genome from Beijing isolate of China
HE Zhongping,ZHOU Yusen
（Research Center of Virology, Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011, China）
ZHANG Qiyun, et al.
【Abstract】 Objective To obtain the complete TT virus genome from a Beijing isolate of China.Methods PCR was performed for amplifying the TT virus genome from serum of a patient with non A-G hepatitis. Five overlapped fragments, that are 199 bp(1-199), 1 267 bp(90-1 356),878 bp(1 354～2 231),1 129 bp(2 178-3 306),434 bp(3 306-3 739), respectively, were obtained. These PCR products were sequenced by standard method.Results The complete TT virus genome of Beijing isolate consists of 3 739 nucleotides involving two ORFs. The first ORF locates at 589-2 902 nt,encoding 770 amino acids, the second ORF locates at 107-715 nt,encoding 202 amino acids. 5′ and 3′ termin of the genome are non-coding regions including 106 bp and 837bp respectively. In this genome, A is 31.2%, C 25.4%, G 22.5% and T 20.9%. The homology of Beijing isolate and Japanese TT virus was more than 95% at both nucleotide and amino acid levels.Conclusion We successfully cloned and sequenced the complete TT virus genome from a Chinese patient. This Beijing TT virus isolate and that reported by Japan all belong to a same genotype.
【Key words】 Gene, viral; Base sequence; Polymerase chain reaction; TTV
已知6种肝炎病毒(A～E，G)都有其特异的检测方法，但仍有未知病原的肝炎发生，提示有新的肝炎致病因子存在。1995年庚型肝炎病毒(HGV)的发现，使大约10%～20%的非甲～戊型肝炎的病因得到可能的解释。1997年日本学者报道一种与肝功能异常有关的DNA病毒，并把此病毒命名为TT病毒(TTV)。我们的初步研究表明，我国不同人群和不同肝炎病人中存在TTV感染。为了解TTV北京地区分离株的基因结构与特征，建立适合我国肝炎病人的诊断方法以及了解我国TTV的基因变异情况，我们测定了1株北京地区非甲～戊型肝炎病人的TTV全基因序列。
1 材料和方法
1.1 血清标本 血清标本采自北京地坛医院的1例非甲～庚型肝炎病人。
1.2 实验试剂 克隆载体(T-vector)、XL1-Blue菌为美国Invitrogen公司产品。Taq酶、dNTPs、T4DNA为华美公司产品。STG试剂盒购自Biotronic公司，QIAprep MiniPrep质粒提取试剂为QIAgen公司产品。
1.3 TTV全基因的克隆 用PCR技术分段扩增克隆TTV全基因并测定其核苷酸序列。
1.4 引物设计 参考日本已发表TTV的全基因序列(AB008394)设计一套引物。所设计合成的下述重叠引物贯穿了参考序列的全序列。引物序列为：P1/P2(1-199),P1:5′-ATTTGCTACGTCACTAACC-3′;P2:5′-GTGTGTAAACTCACCTTCGT-3′。P3/P4(90-1356),P3:5′-AGTAAGTGCACTTCCGAATG-3′;P4:5′-TGAGCCGAACGGATATTGCA-3′。P5/P6(1354-2231),P5:5′-TCACCACTAACTGACTCTGT-3′;p6:5′-GGATACCATTTTAAAGAGTA-3′。P7/P8(2178/3306),P7:5′-AATGCCAGGAGGTAGTAGTA-3′;P8:5′-GCCATTGGACTCAGGAGCT-3′。P9/P10(3306-3739),P9:5′-TAGCTCCTGAGTCCAATGGC-3′;P10:5′-GCCGACGGTTTTTTGGCGC-3′。
1.5 TTV DNA的提取 100 μl血清加130 μl STG缓冲液，混匀，100℃变性5 min，2 500 r/min离心10 min，挑除变性蛋白，加180 μl异丙醇沉淀，室温离心，沉淀物干燥后用无菌水20 μl溶解备用。
1.6 PCR扩增条件 在0.5 ml的离心管内加入10×PCR缓冲液3 μl，P1/P2(或P3/P4，P5/P6，P7/P8，P9/P10)引物各0.2 μmol/L，dNTPs100 μmol/L，Taq酶1 U，总体积30 μl。按下述条件扩增：94℃180 s，94℃50 s，55℃50 s，72℃60 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。取10 μlPCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。
1.7 克隆及测序方法 扩增阳性的PCR产物纯化后，直接与T载体(pBluescript-T vector)连接，转化XL1-Blue宿主菌。挑取白色菌落用PCR和酶切鉴定，对阳性菌落接种培养，提取质粒DNA。采用ABI377型自动测序仪测序。每个克隆均双向测序。
1.8 DNA序列的计算机分析 采用CLUSTAWL的ALIGNMENT程序进行多个序列的比较，引物设计及分析使用GOLDKEY和OLIGO软件。
2 结果
2.1 北京地区TTV全基因克隆及序列测定 用PCR技术分段扩增出5个互相重叠的片段，纯化后直接与T vector连接后进行克隆、双向测序。北京地区TTV(TTV BDH1)DNA的核苷酸全序列见图1。此序列已注册GenBank,序列号为AF116842。该序列全长3 739个核苷酸，有2个开放读码框架。第1个ORF位于589至2 902位核苷酸，编码770个氨基酸，第2个ORF位于107至715位核苷酸，编码202个氨基酸。两端为非编码区，5′端为106 bp，3′端为837 bp个核苷酸。4种碱基在基因组中所占的比例为：A 31.2%(1 168/3 739)，T 20.9%(781/3 739)，G 22.5%(840/3 739)，C 25.4%(950/3 739)；G+C占47.9%，A+T占52.1%。
图1 北京地区TTV分离株的核苷酸全序列
Fig.1 Complete nucleotide sequence of TTV isolate in Beijing region
2.2 北京地区TTV分离株与其他TTV分离株核苷酸和氨基酸的同源性比较 将测定的序列用BLAST程序与GenBank中的序列进行比较，结果表明，我国北京地区TTV分离株与日本发表的TTV全基因序列(AB008394)具有极高的同源性。核苷酸和氨基酸同源性均大于95%，表明两者同属于同一基因型。
3 讨论
病毒性肝炎是危害人类健康的重要疾病之一。已知的甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒是导致人类急、慢性肝炎的最主要的病原因子。自从1989年美国疾病控制中心(CDC)的Bradley等首次报道从NANB肝炎病毒感染的黑猩猩的血液及肝脏中克隆了NANBH相关的病毒基因片段，即著名的5-1-1片段。这一片段被认为是丙型肝炎的病原的基因片段，故将其命名为丙型肝炎病毒(HCV)［1］。自此，拉开了寻找新型肝炎致病因子的序幕。1990年，这一研究小组从病毒的基因克隆入手，克隆了肠道传播的非甲非乙型肝炎的病毒基因片段［2］。但是，在排除上述五种肝炎病毒感染、巨细胞病毒、EB病毒感染外，约有10%～20%的病毒性肝炎病人病因不明，提示标志肝炎的字母符号还需扩展［3，5］。1996年，Leary和Linnen等人［6，7］分别发现了HGV/GBV-C，并克隆和测定了全基因序列，但目前对HGV/GBV-C的致病性看法不同［12］。1997年10月，日本学者Nishizawa等［8］采用代表性差异技术，从一个输血后肝炎病人中克隆到一个500 bp的片段(N22)。通过分子流行病学研究，证实N22与输血后肝炎有高度特异性。同年，Okamoto等［9］测定了TTV全基因序列，首次系统地揭示了TTV的基本特征。至此，NANBH的病原学研究取得了突破性进展。
TTV与已知的动物单股DNA病毒相似的有圆环副链DNA病毒(圆环病毒科如鸡贫血病毒)，线状细小病毒科(如人细小病毒HPV B19，腺联病毒AAV)。Okamoto等人的资料显示，TTV是一个3.7 kb的无包膜的单股DNA病毒，可能属于细小病毒科。TTV含两个开放读码框架(ORF)、ORF1位于该基因组的589-2 898位核苷酸，编码770个氨基酸，其N端是富含精氨酸的高亲水区；ORF2位于107-712位核苷酸，编码202个氨基酸。其基因全长3 739个核苷酸，其中A占31%(1163)，C占26%(954)，G占23%(842)，T占21%(780)，有12个TATA序列，两个多腺苷酸化信号(AATAAA)，这些特征与细小病毒相似。TTV在各种人群中分布极为广泛，在非甲～戊爆发型肝炎中，TTV阳性率为47%(9/19)；非甲～戊慢性肝病中，TTV阳性率为46%(41/90)，其中慢性肝炎47%(15/32)，肝硬化48%(19/40)，肝癌39%(7/18)；血友病人TTV阳性率为46%(26/57)，献血员病人TTV阳性率为12%(34/290)［8，9］。
在非甲～庚型肝炎病人中，TTV阳性率为43%(48/112)，甲～戊型肝炎病人中，TTV阳性率为5.3%(9/270)，ALT升高的献血员中，TTV的阳性率为34.6%(9/26)，ALT正常的献血员中为16.8%(28/166)［10，11］。可见TTV与非甲～庚型肝炎以及肝功能异常有密切关系。
Okamoto等［9］根据78个TTV部分序列分析结果，将序列之间的差异达30%分为两群，G1群有76个分离株，G2群有2个分离株；序列之间差异在10%～15%分为亚群，分别为G1a、G1b和G2a、G2b。这些资料提示，TTV可能存在不同的基因型和变异株。我们测定的北京地区TTV全基因序列，全长3 739个核苷酸，有2个开放读码框架(ORF)。ORF1(nt 589-2902)和ORF2(nt 107-715)分别编码770和202个氨基酸。两端为非编码区，5′端3′端分别为106和837 bp。基因组中G+C占47.9%(G 22.5%，C 25.4%)，A+T占52.1%(A 31.2%，T 20.9%)。与日本TTV分离株(AF008304)全序列比较，两者之间的核苷酸和氨基酸同源性都超过95%，基因变异甚小，可能属于同一基因型。有关TTV的起源、分型和基因变异情况，还需更多的全序列比较研究。
我们对16例TTV PCR和斑点杂交均阳性的非甲～庚型肝炎病人的临床资料总结表明，此型肝炎的临床特点为：症状轻，黄疸轻微，以单相血清转氨酶轻、中度增高为主，病程稍长，少数病人病程可超过两年，血清转氨酶可有波动。TTV传播方式是以输血传播为主，还是以肠道传播为主，是否属于肠道传染性肝炎病毒，以及TTV在人体的分布，如TTV在外周血单核细胞(PBMC)和肝组织的感染和复制情况等，有待于进一步通过临床分子流行病学调查及原子杂交和原位PCR技术对TTV的临床致病机理进行研究。
作者单位：王海涛（军事医学科学院微生物流行病学研究所11室）
参考文献
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