滴金免疫法快速检测肾综合征出血热血清特异性IgM的研究

　　【摘要】　目的　建立一种快速、敏感、适于基层应用的检测肾综合征出血热患者血清特异性IgM的方法。方法　将汉坦病毒核蛋白点于硝酸纤维薄膜上，用来捕获血清标本中的肾综合征出血热病毒特异性IgM，通过胶体金标记的抗人μ链单克隆抗体直接显色，阳性者出现红色斑点。结果　整个试验过程仅需2～4分钟，操作简单。用该法与酶联免疫吸附试验对比检测45份肾综合征出血热患者血清标本，两法均阳性为41份，两法均阴性为2份，总符合率为96%。结论　滴金免疫法简便、快速，适于基层应用，可用于肾综合征出血热的早期诊断及流行病学研究。

　　Dot immunogold filtration assay for rapid detection of anti-HFRSV IgM in patient serum　Zhao Zhongfu^*, Guo Jinjun, Yan Xiaojun, et al. ^*Affiliated Hospital of Changzhi Medical College, Changzhi 046000

　　【Abstract】　Objective　To establish a more rapid and simple method for detecting anti-hemorrhagic fever with renal syndrome virus (HFRSV) IgM in patient serum.Methods　A dot immunogold filtration assay (DIGFA) was developed by coating the nucleocapsid protein of HFRSV on nitrocellulose (NC) membrane, labeling anti-human IgM μ chain monoclonal antibody with colloidal gold. The whole procedure could be finished in 2 to 4 minutes.Results　The coincidence rate of the results of simultaneous determination of serum samples with ELISA and DIGFA was 96% for anti-HFRSV IgM.Conclusions DIGFA, more simple and rapid, is applicable to small medical laboratories. It could be applied for early diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS).

　　【Key words】　Hemorrhagic fever with renal syndrome　　Immunoglobulin M　　Immunohistochemistry

　　肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是常见人畜共患病之一，临床诊治过程中早期明确诊断直接关系患者的预后，现有的诊断方法，在基层单位应用有条件限制，本研究应用滴金免疫法(dot immunogold filtration assay,DIGFA)检测患者血清中特异性IgM抗体，试图建立一种快速、敏感、适于基层医疗单位的诊断方法，现报告如下。

材料与方法

　　一、材料

　　1.汉坦病毒核蛋白：为细胞培养抗原。病毒的细胞培养液经离心后，取上清液加甲醛进行灭活，然后经Sepharose 2B层析柱纯化，收集汉坦病毒核蛋白进行浓缩，加保护剂后，置-20℃保存^［1，2］。

　　2.抗人μ链单克隆抗体^［3］：第四军医大学免疫学教研室提供，小鼠腹水经分段盐析，彻底透析除盐后，DEAE-Sephadex A50层析柱纯化，调整蛋白含量至2 mg/ml，冻存备用。

　　3.氯化金：购于成都化工厂。用去离子水配制成1%的水溶液，4℃保存。

　　4.血清标本：长治医学院附属医院传染科收集肾综合征出血热患者血清45份，乙型肝炎患者血清20份，健康人血清40份，上述血清分别经酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测确定。

　　5.抗肾综合征出血热病毒IgM ELISA试剂盒：购于上海科华实业公司。

　　二、方法

　　1.原理：间接法检测血清IgM。汉坦病毒核蛋白包被在微孔滤膜上，检测时将血清滴于其上，再加胶体金标记的抗μ链单抗，若血清中有特异性IgM存在，则可在膜上形成红色斑点。

　　2.胶体金制备：用柠檬酸还原法制备胶体金。取0.02%氯金酸溶液100 ml加热煮沸,剧烈搅拌下迅速一次加入1％柠檬酸三钠4 ml，待溶液变成葡萄酒红色后继续煮沸10分钟，冷却后置4℃保存。

　　3.胶体金抗人μ链单克隆抗体结合物制备：取胶体金溶液1ml，用0.1 mol/L K₂CO₃调pH值至8.2，加入抗人μ链单克隆抗体40 μg，迅速混匀。10分钟后，加入小牛血清白蛋白(BSA)至终浓度为1%，3 000 g离心5分钟，取上清液，12 000 g离心20分钟，弃上清液，沉淀用20 μl含1% BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，即为胶体金抗人μ链单克隆抗体结合物^［4］。

　　4.微孔滤膜处理及汉坦病毒核蛋白包被：硝酸纤维素薄膜（孔径0.65 μm）用去离子水浸泡，取出晾干，制成1 cm直径的圆片。用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液浸泡，晾干后，将1 μl的汉坦病毒核蛋白点于膜片中央，室温干燥后，用0.5% BSA封闭，然后用PBS洗涤两次，置干燥器中干燥，并保存于4℃。

　　5.免疫渗滤装置：将干燥的抗原膜片点样面朝上装入自制的塑料小盒中，盒盖中央有一直径0.6 cm的小孔，盒内塞满一次性尿布中的吸水材料。

　　6.试验方法：在膜的中央点1滴洗涤液(0.01 mol/L PBS)活化膜表面，待渗入。加血清标本1滴，待渗入。用洗涤液冲洗3遍后加入胶体金抗人μ链单克隆抗体结合物1滴，待渗入，用洗涤液冲洗3遍后，观察结果^［5］。阳性者在膜中央出现红色斑点，阴性则无红色斑点形成。

　　7.ELISA试验：严格按说明书操作。

结果

　　1.滴金免疫法与酶联免疫吸附法的比较：DIGFA与ELISA（特异性IgM抗体捕捉）对比检测肾综合征出血热患者血清45份，结果见附表。两法总符合率为96%，经χ²检验，P＞0.05。

　　2.非肾综合征出血热患者血清检测结果：用DIGFA法检测20份乙型肝炎患者和40份健康人血清,均为阴性。

附表　DIGFA与ELISA法检测患者血清

　　抗肾综合征出血热病毒IgM结果(份数)

　　3.重复性试验：随机选择上述肾综合征出血热阳性血清和阴性血清各10份，重复检测5次，均测定出相同的结果。

　　4.阻断试验：随机抽取阳性标本10份，各取30 μl分别加入等量的包被抗原（汉坦病毒核蛋白），37℃水浴1小时，8 000 g离心20秒后，取10 μl进行滴金免疫法检测，结果均为阴性。

讨论

　　滴金免疫法又称为斑点金免疫渗滤试验，是80年代末发展起来的一种快速免疫学测定方法，它是胶体金标记技术与快速免疫斑点结合技术相结合的产物^［6］。其基本原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行（反应时间缩短为数分钟），然后用胶体金标记的抗体来进行直接显色，由于胶体金肉眼可见，故阳性反应者在膜上呈现红色斑点，阴性反应则不会形成红色斑点。滴金免疫法与ELISA相比，特异性、灵敏性几乎相当，但前者具有快速、简便等ELISA所无法比拟的优点^［7］。

　　肾综合征出血热患者多见于农村、牧区、林区等医疗条件相对较差的地区，许多患者因无法得到早期诊断而延误病情，致使死亡率很高。现在临床普遍应用ELISA方法来检测肾综合征出血热血清特异性IgM，该方法虽然准确性较高，但基层人员操作不方便，不能及时作出诊断。本研究建立的测定肾综合征出血热患者血清特异性IgM的滴金免疫法，与ELISA对比测定的符合率为96%。它不失为一种既方便又快速的诊断肾综合征出血热的方法。其原料来源也较容易，制成试剂盒后有广泛应用价值。应当说明的是滴金免疫法本身存在较难进行质量控制的问题，通常可以在微孔滤膜上另加能与标记结合物直接反应的质控品，但这仅能作为实验是否有效的指标，真正的质控还需在同一批试剂中另行测试。故我们建议同一批试剂盒中应包括阳性和阴性对照血清，检测患者血清时，同批次的试剂盒应做一次阴性和阳性对照，是否可行，有待进一步探讨。

参考文献

　　1　黄长形，李盈盈，杨为松，等.肾综合征出血热病毒核蛋白在大肠杆菌中表达及其产物的应用.中华传染病杂志，1996，14：28-31.

　　2　李德新，宋干，杨长寿，等.肾综合征出血热病毒结构蛋白的研究.病毒学报，1996，6：101-104.

　　3　杨为松，张文彬.肾综合征出血热患者对EHFV三种结构蛋白的抗体应答.中华传染病杂志，1992，10：187-190.

　　4　陶义训.快速斑点免疫结合试验在医学检验中的应用评价.中华医学检验杂志，1994，17：197-197.

　　5　肖乐义，阎小君，徐德忠，等.斑点金免疫渗滤试验快速检测抗甲型肝炎病毒IgM抗体.第四军医大学学报，1996，17：441-443.

　　6　Hayat MA. Colloidal gold-principales, methodes and applications. San Diego: Acad Press,1989.23-39.

　　7　Spielberg F, Kabeya CM, Ryder RW, et al. Field testing and comparative evaluation of rapid, visually read screening assays for antibody to human immunodeficiency virus.Lancet,1989,1:580-584.