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Production and application of anti-HRPⅡ single chain Fv antibodies of Plasmodium falciparum
XU Weiwen, DONG Wenqi, LI Ming, et al.
(Institute of Tropical Diseases, First Military Medical University, Guangzhou 510515, P. R. China)
【 Abstract 】 Objective To produce soluble anti-histidine-rich protein (HRPⅡ) ScFv for immuno-colloidal gold-dipstick test of Plasmodium falciparum.Methods The detection ability for HRPⅡ of the ScFvs was performed with immuno-colloidal gold-dipstick model.Results The soluble ScFv antibodies could react not only with recombinant HRPⅡ, but also with the native HRPⅡ in the blood samples from patients infected with P. falciparum. The lowest detection threshold was 1ng/ml. And the sensitivity and specificity were 81.8% and 85.7%, respectively. There is no statistically significant difference compared with that of anti-HRPⅡ McAb (P＞0.05).Conclusion The ScFvs antibodies may prove to be valuable in developing immunological reagents for malaria diagnosis.
【 Subject words 】 Histidine-rich protein; Single chain Fv; Dipstick-immuno-colloidal gold; Plasmodium falciparum
富含组氨酸蛋白Ⅱ（histidine rich proteinⅡ，HRP-Ⅱ）是恶性疟原虫感染，特别是急性感染病人血清中存在的一种特异性标志，目前已被证明是恶性疟最好的诊断靶抗原〔1〕。国外已在此基础上建立了ParaSightTM-F和ICT Malaria P.f.TM等新兴的快速疟疾诊断方法，被WHO推荐使用〔2,3〕。但目前市场价格较高，特别是对疟疾流行较为严重的广大发展中国家，而单抗的连续大量制备也尚存在一定的困难。本研究在成功构建抗恶性疟原虫红内期噬菌体抗体库并从中筛选到能分泌特异性抗HRP-Ⅱ单链抗体克隆株的基础上〔4〕，发酵制备了一定量的可溶性抗HRP-Ⅱ单链抗体，采用本研究室胡旭初等〔5〕建立的Dipstick-免疫胶体金模型对疟疾患者血样中的HRP-Ⅱ进行检测。为研制疟疾快速诊断试剂盒奠定基础。
材料与方法
主要材料和试剂：2×TY-AG，2×TY-A，IPTG(Promega)，胶体金（本室自制）；Millipore超滤系统（Millipore LabscaleTM TFF System，Pellico PLCG 10, 50cm2）；重组恶性疟富含组氨酸蛋白Ⅱ（HRP-Ⅱ）（本室自制）、Dipstick层析条（本室自制）、抗HRP-Ⅱ单抗3A3（本室自制）；疟疾患者血样(采自云南)。
抗体的制备、超滤和纯化：从SOBAG-N平皿中挑取PF22号和PF184号克隆（均为从抗恶性疟原虫红内期噬菌体抗体库中筛选到的、能分泌特异性抗HRP-Ⅱ单链抗体的阳性克隆株），接种于5ml 2×YT-AG培养基，30℃、250r/min振荡培养过夜，次日以1%的体积比转种于500ml 2×YT-A培养基中，30℃ 250r/min振荡培养至吸光度值A600＝0.8时，加IPTG使终浓度为0.2mmol/L进行抗体的诱导表达，诱导温度为30℃，诱导时间20 h。8 000r/min离心20 min，分别留取沉淀和上清。沉淀用渗透休克法获取细胞周质腔中的抗体。上清中的抗体用Millipore超滤系统超滤浓缩。饱和硫酸铵分步沉淀法加Sephacryl-S200分子筛过柱初步分离纯化目的抗体。
单链抗体的活性测定（Dipstick-免疫胶体金法〔5〕）
包被及封闭：用本室自制的Dipstick免疫层析条，用碳酸盐包被缓冲液（pH9.6)稀释抗原（HRP-Ⅱ）和ScFv抗体，使浓度均为1mg/ml，各取3μl在膜上划一条粗细均匀横跨膜的细线，抗原线距吸水纸层0.5cm，抗体线在抗原线下0.5cm。点样后用1%牛血清白蛋白碳酸盐包被缓冲液50μl封闭，自然晾干，剪成4条。
抗HRP-Ⅱ单抗的胶体金标记：参见胡旭初方法〔5〕。免疫胶体金可用塑料滴瓶密封于4℃或室温保存。
单链抗体的活性测定：将浓度为1μg/ml的抗原（HRP-Ⅱ）溶液作1∶10的连续梯度稀释（1×PBS稀释），在塑料盘的凹井内加入25μl，对照为25μl 1×PBS溶液，把Dipstick条放入皿中，待溶液吸干后，加入25μl免疫胶体金，吸干后用PBS-Tween20(pH7.4) 25μl洗涤。靠近滤纸的阳性对照线显红色，抗体包被线显色为抗原阳性，不显色为抗原阴性，能显色的最高抗原稀释度为最低抗原检出量。
稳定性的测定：用ScFv抗体包被并封闭好的Dipstick条用塑料袋密封置于4℃或室温保存，分别于7、15、30 d后与HRP-Ⅱ及血样反应，测定其稳定性。
ScFv的初步应用及评价：用ScFv包被的Dipstick条检测疟疾病人的血样（40份），正常人血作阴性对照。以血涂片镜检法为金标准，将结果与本室制备的抗HRP-Ⅱ单抗检测血样的结果比较，以敏感度和特异度等指标作诊断试验的初步评价。
结果
1.抗HRP-Ⅱ单链抗体的制备：以抗体表达的最优化条件（A600＝0.8，IPTG终浓度0.2mmol/L，诱导温度30℃，诱导时间20 h），对PF22和PF184阳性克隆株进行大量发酵（500ml），分别获取其培养上清、细胞周质和全细胞裂解液中的可溶性单链抗体（图1），培养上清的抗体用Millipore超滤系统〔相对分子质量（Mr）为10×103膜〕超滤，体积由500ml超滤至10ml，浓缩50倍。根据预试结果，我们对大量制备的抗体先用饱和硫酸铵分步沉淀法(50%, 70%)初步分离再经分子筛过柱，最终纯度为42.4%（图2），抗体得率为0.75mg/L培养基。
图1 抗HRP-Ⅱ单链抗体(ScFv)的SDS-PAGE分析
Fig 1. SDS-PAGE analysis of anti-HRP-Ⅱ(ScFvs) on 12% gel
Lane 1: E. coli HB2151; Lane 2: soluble antibody in supernatant of PF22; Lane 3: periplasmic soluble antibody of PF22; Lane 4: intracellular soluble antibody of PF22; Lane 5: soluble antibody in supernatant of PF184; Lane 6: periplasmic soluble antibody of PF184; Lane 7: intracellular soluble antibody of PF184
图2 用饱和硫酸铵纯化的单链抗体
Fig 2. ScFv purification using saturated ammonium sulfate(SAS)
Lane 1: antibody precipitation with 50% SAS； Lane 2: antibody precipitation with 70% SAS； Lane 3: antibody before purification； Lane 4: antibody purified by molecular chromatography
2.Dipstick-免疫胶体金法测定单链抗体的活性：将浓度为1μg/ml的抗原（HRP-Ⅱ）溶液作1∶10的连续梯度稀释，用Dipstick-免疫胶体金法测定单链抗体的活性。结果PF22和PF184在培养上清、细胞周质及细胞中表达的ScFv单链抗体均能与重组HRP-Ⅱ蛋白起显色反应（图3），反应以PF22上清为最明显，PF184反应比PF22稍弱。最低检测抗原量为1ng/ml。粗制抗体与纯化抗体其反应性无异。
3.ScFvs包被的Dipstick条的稳定性：用ScFvs抗体包被并封闭好的Dipstick条用塑料袋密封置于4℃及室温保存，分别于7、15、30 d后检测重组HRP-Ⅱ蛋白及血样中天然HRP-Ⅱ抗原。结果反应性能无明显差异(图4)，表明其稳定性良好。稳定性的进一步测试仍在进行之中。
图3 用包被单链抗体Dipstick-免疫胶体金法测定HRP-Ⅱ
Fig 3. Detection of HRP-Ⅱusing Dipstick coated with soluble ScFvs
1: PF22, 2: PF184, a:soluble antibody in supernatant, b: periplasmic soluble antibody, c: intracellular soluble antibody
A: bands coated with HRP-Ⅱ; B:bands coated with ScFv
图4 ScFvs包被的Dipstick条的稳定性
Fig 4. Stability of Dipsticks coated with soluble ScFvs
a,b,c,d were dipsticks coated with soluble ScFvs stored at room temperature for 0,7,15, and 30 days
A: bands coated with HRP-Ⅱ; B:bands coated with ScFv
4.ScFv的初步应用及评价：以反应性良好的PF22培养上清ScFvs包被制成Dipstick测试条，用Dipstick-免疫胶体金模式检测疟疾病人血样40份，正常人血作阴性对照。结果ScFvs可与恶性疟疾病人血样起显色反应（图5）。以镜检为金标准，其敏感度为81.8%，特异度为85.7%（表1）。该结果与本室制备的抗HRP-Ⅱ单抗检测血样的结果在敏感度、特异度差异均无显著性（P＞0.05）（单抗3A3的敏感度和特异度分别为87.5%和85.7%）。该结果表明，用噬菌体抗体库技术获得的抗HRP-Ⅱ单链ScFvs可以用作检测试剂。
表1 用Dipstick-免疫胶体金技术进行单链抗体的诊断试验
Table 1. Diagnostic test with ScFvs by Dipstick-immuno-colloidal gold method
| 3A3 | PF22 ScFv | ||||
| + | - | + | - | ||
| + |
28 |
5 |
27 |
6 | |
| - | 1 | 6 | 1 | 6 | |
| Total | 29 | 11 | 28 | 12 | |
图5 用ScFv包被Dipstick-免疫胶体金进行血样分析
Fig 5. Analysis of blood samples using Dipstick coated with ScFvs
1: soluble ScFv from supernatant of PF22, 2: soluble ScFv from supernatant of PF184
a: blood samples from patients infected with P.f, b: blood sample from patient infected with P.v
A: bands coated with HRP-Ⅱ, B: bands coated with ScFv
（图中A上方的条带是层析条折纸痕）
讨论
单抗捕捉抗原法〔6〕以及新近以单抗为基础的Dipstick技术〔7〕，以其快速（1～2 min出结果）、简便（成品用于测试时无需特殊的仪器和试剂，操作简单，结果易于判读，运送、携带和储存方便）、可靠（结果判读客观，稳定性、重复性好）等优点，在疟疾诊断上日渐受到重视并展示了广阔的应用前景〔8〕，WHO也已将Dipstick的产品（ParaSightTM-F和ICT Malaria P.f.TM）作为快速诊断恶性疟的方法予以推广应用，但目前市场价格较高，且单抗的连续大量制备尚存在一定困难。
我们采用噬菌体抗体库技术这一高效的表达、筛选新体系〔9〕，成功构建了抗恶性疟原虫红内期噬菌体抗体库并从中筛选到能分泌特异性抗HRP-Ⅱ单链抗体克隆株〔4〕。为进一步验证用该法制备的基因工程单链抗体的生物学活性，我们发酵制备了一定量的可溶性抗HRP-Ⅱ单链抗体，采用本研究室胡旭初等〔5〕建立的Dipstick-免疫胶体金模型，将其初步应用于疟疾患者血样的检测。结果，本研究中制备的抗HRP-Ⅱ单链抗体，能与HRP-Ⅱ靶抗原起特异性免疫反应，用该抗体制成的Dipstick测试条，免疫胶体金法能特异性检测恶性疟患者血样中的天然HRP-Ⅱ。用该Dipstick条共检测疟疾患者血样40份（镜检结果：恶性疟33份，间日疟7份），阳性27份(其中1份为假阳性)，其敏感度和特异度分别为81.8%和85.7%。该结果与本室郝文波等制备的抗HRP-Ⅱ单抗3A3制成的Dipstick检测结果（敏感度87.5%；特异度85.7%）相比，统计学上差异无显著性（P＞0.05）。与国外报道〔10〕Dipstick法(ParaSightTMF)诊断疟疾的敏感度介于84.2%～93.3%之间、特异度为81.1%～99.5%相比，我们虽只是小样本测试，却有着令人鼓舞的结果。扩大样本量的测试及与澳卡（ICT Malaria P.fTM）的平行检测试验将在下一步进行。
在稳定性方面，用单链抗体包被并封闭好的Dipstick条用塑料袋密封置于4℃及室温保存，30 d后仍能用于疟疾患者血样检测，显示了良好的稳定性，适合在现场特别是较贫困的地区使用；稳定性的进一步测试仍在进行之中。这一研究结果表明，用噬菌体抗体库技术制备的抗HRP-Ⅱ单链抗体，有着作诊断试剂的良好潜质，为研制疟疾快速诊断试剂盒奠定了基础。而就我们制备的抗体而言，其产量并不高（0.75 mg/L），但包被一张Dipstick条，其抗体用量只需0.75μg。摇瓶发酵1 000ml，就可制作1 000张Dipstick条。若将来改用高效表达载体，并用发酵罐生产，有望获得较高产量抗体而进一步降低成本〔11〕，具产业化前景，有开发应用的价值。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600127)；WHO/TDR资助题(ID970498)
参考文献
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2，WHO. A rapid dipstick antigen capture assay for the diagnosis of falciparum malaria. Bull WHO, 1996, 74:47.
3，Thepsamarn P, Prayoollawongsa N, Puksupa P, et al. The ICT Malaria Pf.: a simple, rapid dipstick test for the diagnosis of Plasmodium falciparum malaria at the Thai-Myanmar border. Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth, 1997, 28:723-726.
4，董文其，徐伟文，李明，等. 抗恶性疟原虫噬菌体抗体库的构建及目的抗体的筛选. 中国学术期刊文摘, 1999, （2）：212-215.
5，胡旭初，李明，王萍，等. 一种新型免疫快速检测技术-Dipstick免疫胶体金技术. 中华流行病学杂志. 1998, 19(5-B):204-207.
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8，Uguen C, Rabodonirina M, De Pina JJ, et al. ParaSight-F rapid manual diagnostic test of Plasmodium falciparum infection. Bull WHO, 1995, 73:643-649.
9，Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE, et al. Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol, 1994, 12:433-455.
10，祝卫东，汤林华. 疟疾诊断新方法及其在监测中的应用. 国外医学寄生虫病分册, 1997, 24(4):148-151.
11，Sergey MK, Gerhard M, Melvyn L, et al. High level production of soluble single chain antibodies in small-scale Escherichia coli cultures. J Immunol Meth, 1997, 200:69-77.