Literature
首页合作平台医学论文临床医学与专科论文检验医学

戊型肝炎病毒线性抗原表位克隆及表达的初步研究

来源:中华微生物学和免疫学杂志
摘要:【摘要】目的探讨戊型肝炎病毒线性抗原表位的克隆表达策略。方法合成HEVORF3羧基端19个氨基酸编码DNA序列,在序列的5′端加入了两个甘氨酸序列,通过基因扩增载体中的5′GGGG/CCCC非对称粘性末端,实现线性表位序列的首尾串联排列。结果获得了2mer、4mer、6mer、8mer4个首尾串联的重复序列。分别克隆到表达载体pQE30......

点击显示 收起

【 摘要 】 目的 探讨戊型肝炎病毒线性抗原表位的克隆表达策略。方法 合成HEV ORF3羧基端19个氨基酸编码DNA序列,在序列的5′端加入了两个甘氨酸序列,通过基因扩增载体中的5′GGGG/CCCC非对称粘性末端,实现线性表位序列的首尾串联排列。结果 获得了2mer、4mer、6mer、8mer 4个首尾串联的重复序列;分别克隆到表达载体pQE30中后,在IPTG诱导下主要以包涵体形式表达,其中4mer蛋白占细菌蛋白的21.6%,6mer蛋白占细菌蛋白的13.5%,而含8mer的重组菌不表达目的蛋白,首尾串联后每一个线性表位的两端都存在被梭菌蛋白酶识别的特异序列,表达产物可以被重新酶解成小分子肽,经梭菌蛋白酶消化的表达产物可以检测到一定的抗原反应性。结论 通过首位串联可以实现HEV线性表位较高效的表达。

Cloning and expression a linear epitope from hepatitis E virus

XIA Xiaobing, HUANG Rutong, LI Derong.

  (Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850, P. R. China)

  【 Abstract 】 Objective To develop a biological system methods for the mass production of epitope from hepatitis E virus.Methods The epitope gene was tandem multimerized to 2-mer, 4-mer, 6-mer and 8-mer. Each of the repeating units in the tandem multimers was connected to neighboring gene by a DNA linker encoding Gly-Arg-Pro at the N-terminal and Pro-Arg-Gly at the C-terminal for the cleavage of multimers by clostripain.Results The multimer were cloned into the expression vector pQE30 and expressed in E.coli M15 with isopropyl β-D-thiogalatopyranoside induction. The expression multimeric peptides encode by the 4- and 6-mer accumulated intracellularly as inclusion bodies and comprised about 21.6%, 13.5% of the E.coli protein respectively, while the pQE30 vector harboring 8-mer gene failed to express in E.coli. The multimeric peptides expressed were cleaved with clostripain, and the antigen reactivity of monomer epitope was examined by ELISA.Conclusion High level expression of epitope from HEV could be achieved by tandem repeats.

  【 Subject words 】 Hepatitis E virus; Linear epitope; Tandem repeats

  线性表位等小分子肽的相对分子质量小,在工程菌中表达时易受到宿主蛋白酶的降解。尽管进行融合表达能解决产物的降解问题,但由于小分子肽在融合蛋白中所占比例很小,产量较低。 解决方法之一就是进行基因串联表达,用这种方法生产的小分子肽不但产量高,而且易于纯化,尤其对于一些药用小分子肽,如心钠素、血管紧张素酶抑制剂(ACEI)等具有很好的应用前景〔1〕

  Yarbough等〔2〕详细分析了HEV的线性抗原表位,利用合成的线性表位检测病人标本,发现ORF3与ORF2羧基端的线性表位的检出率最高,说明其抗原反应性较强。本实验合成了编码HEV ORF3羧基端19个氨基酸的DNA序列,利用构建好的基因首尾串联扩增载体,实现该序列的首尾串联排列与原核表达。本研究也可为其它小分子肽的基因工程表达提供参考。

  材料与方法

  菌株与质粒:E.coli JM109、E.coli M15,克隆质粒pBlue-SK(+)、表达质粒pQE30均为本室保存。

  基因扩增载体的构建:寡核苷酸Ⅰ、Ⅱ加入到T4 DNA 连接酶buffer中,85℃加热5 min,然后缓慢降至4℃,在4℃放置30 min后,加入经BamHⅠ+HindⅢ消化的pBlue-SKⅡ(+)进行连接。

  含HEV ORF3线性表位序列首尾串联载体的构建:寡核苷酸oligoORF3a与oligoORF3b经过变性后缓慢退火,加入T4 DNA连接酶,反应结束后、再加入经BpiⅠ线性化的扩增载体,连接产物转化E.coli JM109。

  含HEV ORF3线性表位序列首尾串联表达载体的构建:挑选分别插入了4、6、8个首尾串联体(4mer、6mer、8mer)的阳性重组子,酶切、回收目的片段与pQE31连接。

  表达产物的酶解:取经过SDS-PAGE纯化的表达产物,加入梭菌蛋白酶,37℃消化3 h。

  表达蛋白的活性检测:电泳回收产物及其酶解产物直接用ELISA分析;包涵体用透析液悬浮,室温放置30 min,取一部分悬浮液进行酶解,12 000×g 15 min离心,非酶解上清与酶解上清物皆用ELISA分析; ELISA方法参考文献〔3〕。

  结果

  1.扩增载体的构建:合成了2条寡核苷酸,其中oligoⅠ含有一个BpiⅠ位点及一个BamHⅠ粘性末端,oligoⅡ含有一个反向的BpiⅠ位点及1个HindⅢ的粘性末端,在连接酶buffer中退火形成:5′GATCC(GAAGACCC)GGGGCCGTCTTCA;GCTTCTGGGCCCC(GGCAGAAG)TTCGA5′,可以克隆到经BamHⅠ及HindⅢ消化的pBblue-SKⅡ(+)中,形成扩增载体pBpiⅠ。经BpiⅠ酶切后,在新载体上可以产生由4个碱基组成的非对称粘性末端5′GGGG/CCCC,该粘性末端可以用来扩增外源DNA片段,实现基因的首尾串连。

  2.含HEV ORF3线性表位序列首尾串联多聚体的构建:位于HEV ORF3羧基端19个氨基酸的线性表位序列为R-P-S-A-P-P-L-P-H-V-V-D-L-P-Q-L-G-P-R,考虑到原核表达的需要,根据E.coli的偏性密码子合成了一对互补的63mer的寡核苷酸序列,退火后可以形成非对称粘性末端5′GGGG/CCCC5′,用于插入经BpiⅠ消化的pBpiⅠ中,也利于自身连接形成首尾串联。我们在该序列中还设计了梭菌蛋白酶识别位点(梭菌蛋白酶特异性识别Pro、Gly、Arg 3个连续残基中Gly-Arg组成的肽键〔2〕);即合成的DNA片段除编码HEV ORF3羧基端的19个氨基酸的线性表位外,还编码由2个甘氨酸组成的linker,该linker与线性表位N-端的Pro-Arg残基相连,由于线性表位C-端的氨基酸残基为Arg-Pro,因此实现首尾相连后,每一个线性表位的N-端及C-端都含有梭菌蛋白酶特异性识别位点。

  寡核苷酸序列退火后进行自身连接,回收2mer,与经BpiⅠ消化的pBpiⅠ连接。用T7与T3启动子序列通用测序引物进行PCR扩增,鉴定出插入了线性表位2mer的阳性克隆质粒pBpiⅠ-2mer。取扩增产物经BpiⅠ酶切后进行自身连接,再与经BpiⅠ消化的pBpiⅠ连接。最后我们挑选到了分别插入了含线性表位四聚体(4mer)、六聚体(6mer)、八聚体(8mer)的克隆质粒(pBpiⅠ-4mer、pBpiⅠ-6mer、pBpiⅠ-8mer)。

  3.首尾串联序列的表达及其产物的SDS-PAGE鉴定:将线性表位序列首尾串联体克隆到pQE30载体中连接,转化受体菌E.coli M15。分别用IPTG进行诱导。SDS-PAGE结果表明,在含有4mer及6mer的重组菌中都能观察到目的蛋白的表达,相对分子质量(Mr)分别为14×103、16×103左右,分别达到细菌蛋白的21.6%、13.5%,而含8mer的重组菌中不表达目的蛋白(图1)。收集菌体并进行超声破菌,对超声后上清以及沉淀进行SDS-PAGE分析,结果表明两种表达产物均主要以包涵体形式存在于胞内(图2)。

  图1 首尾串联片段表达产物的SDS-PAGE分析

  Fig 1. Analysis of expression products of tandem repeated epitope with SDS-PAGE

  A: Protein size marker; B: E.coli M15; C: E.coli-pBpi-4mer; D: E.coli-pBpi-6mer; E: E.coli-pBpi-8mer

  4.表达产物初步纯化、酶解后测抗原反应性:获得4mer的表达产物,经初步纯化及梭菌蛋白酶酶解后,用ELISA法测定其抗原反应性。试验用的阴性及阳性血清经重组抗原试剂盒及全病毒抗原试剂盒检测确定。ELISA测定以梭菌蛋白酶为空白对照,从吸光度(A)值反映无抗原反应性。表达产物经酶解后,A值从酶解前0.17升至0.33,表明有一定的抗原反应性。

  讨论

  HEV ORF3端19个氨基酸构成的线性表位具有一定的抗原反应性,活性检测方法简单,可以用于建立小分子肽基因工程表达的模型。一般来说,在同一启动子控制下,表达水平与mRNA的稳定性密切相关,本研究将几个线性表位首尾串联体置于大肠杆菌噬菌体来源的强启动子(T5)的控制下,因此mRNA的转录与翻译并不同步,其中转录过程比翻译过程要快得多,在转录后存在未受到核糖体保护的mRNA,易受到RNA酶的攻击。而串联重复单位越多,其mRNA分子越大,越易受到RNA酶的攻击〔5〕。除此之外,我们在设计DNA序列时尽管选择了大肠杆菌的偏性密码子,但连接序列依旧是大肠杆菌很少使用的密码子,如GGG,CCC等,因此串联重复单位越多,这些密码子出现的频率越高,目的产物的表达量就越低。

  图2 SDS-PAGE分析目的蛋白表达形式

  Fig 2. SDS-PAGE characterize tandem repeated epitope expressed in E.coli

  A: Protein size marker; B: Undissoved fragments of E.coli-pBpi-6mer lysate; C: Dissolved fragments of E.coli-pBpi-6mer lysate; D: Undissolved fragments of E.coli-pBpi-4mer lysate; E: Dissolved fragments of E.coli- pBpi-4mer lysate

  但基因串联表达系统不是很稳定,重组菌进行了连续传代后,在SDS-PAGE上观察不到表达蛋白。在连续传代实验中,我们并未发现质粒丢失,只是酶切鉴定后观察不到目的片段。我们最先怀疑是目的片段丢失,于是将含pBpiⅠ-4mer、pBpiⅠ-6mer的重组菌连续传代,酶切后也没有观察到目的条带, 而用T3及T7通用引物进行PCR扩增后能检测到2mer或单一片段。这可能是质粒复制过程中的同源重组造成的,同源重组不仅发生在表达质粒中,也发生在克隆质粒中。Lovett等〔6〕发现含首尾串联基因的载体之间发生的同源重组并不依赖于RecA蛋白,作者提出了一个非RecA蛋白依赖的姊妹链交叉模型,用于解释重复序列的缺失,即在重复序列处由于相应链的错配而导致遗传重组。最近我们比较了pBpiⅠ-6mer在其它宿主菌中的稳定性,结果发现,不同的宿主菌系统差异比较明显,其中以Invitro gene公司的TOPO最为稳定,连续传15代也未能观察到同源重组现象。另外,降低培养温度也可能是一条有效的途径,最近还发现,30℃条件下在JM109系统中也比较稳定。

  包涵体经过梭菌蛋白酶酶解后,抗原反应性也稍有升高,这应该是由于梭菌蛋白酶能酶解以包涵体形式存在的表达蛋白。通过SDS-PAGE,可以观察到包涵体酶解后,目的蛋白有一定程度的减少,说明表达产物能被梭菌蛋白酶酶解,其机理还有待于进一步研究。

  参考文献

  1,Shibui T, Kamizono MU, Takizawa Y, et al. High level expression of human propoliprotein A-I in Escherichia coli using expression plasmids containing tandemly polymerized propoliprotein A-I structural genes. Appl Micro Biotech, 1989, 31:518-523.

  2,Yarbough PO, Tam AW, Fry KE, et al. Hepatitis E Virus: identification of type-common epitopes. J Virol, 1991, 65:5790-5797.

  3,洪世雯, 何红霞. 以人工合成肽为抗原的HEV抗体检测方法的建立和评价. 中国病毒学,1996, 11:120-123.

  4,Gilles AM, Imhoff JM, Keil B. α-Clostripain. J Biol Chem, 1979, 254:1462-1470.

  5,Isot I, Dreyfus M. The stability of Escherichia coli lacZ mRNA depends upon the simultaneity of its synthesis and translation. EMBO J, 1995, 14:3252-3255.

  6,Lovett ST, Gluckman TJ, Simon PJ, et al. Recombination between repeats in Escherichia coli by a rec A-independent, proximity-sensitive mechanism. Mol Gen Genet, 1994, 245:294-298.


作者: 夏小兵 2009-2-21
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具