nNOS片段在大肠杆菌中的表达及特异性抗体的制备

nNOS片段在大肠杆菌中的表达及特异性抗体的制备

中国免疫学杂志 1999年第2期第15卷 免疫学技术与方法

作者：陈　强　朱敏生　沈　月　许祥裕　潘　英　朱东亚　丁树标　智　刚　Kim S Lau　James T Stull

单位：南京军区军事医学研究所，南京 210002

关键词：nNOS；特异性抗体；重组表达；肌肉

　　中国图书分类号　R392-33

　　摘　要　目的：为了制备nNOS特异性抗体。方法：用PCR的方法克隆出nNOS 708～881 aa片段的编码基因并将之插入pET28a原核表达载体。结果：成功地在大肠杆菌中获得高效表达。经HisTag-Sepharose和电泳回收法得到纯蛋白，将此蛋白免疫兔，制备出nNOS特异性抗体，抗体效价可达1∶8 000。利用该抗体成功地检测了正常肌肉和DMD肌肉中nNOS的含量变化，证实DMD肌肉中nNOS的含量明显低于正常肌肉。结论：制备的抗体具有较高的特异性，对nNOS的免疫检测具有重要应用价值。

Recombinant expression of nNOS fragment in E.coli and preparation of specific antibody against nNOS

CHEN Qiang,ZHU Min-Sheng,SHEN Yue et al.

　　Nanjing Military Institute of Medical Science,Nanjing 210002

　　Abstract Objective：To prepare the specific antibody against nNOS.Methods：Cloned a gene fragment coding 708 to 881 aa of nNOS with PCR and inserted the fragment into a pET28a expression vector.Results:Recombinant protein was expressed effectively in E.coli and purified with HisTag-Sepharose and electrophoresis.Using the pure protein as antigen,immunized rabbits and obtained high specific and high titer(1∶8 000) antibody against nNOS. Western blot assay showed that nNOS expressed in normal skeletal muscle is much higher than that in DMD skeletal muscle.Conclusion:The anti-nNOS antibody with a good specificity was prepared and the antibody was useful for immunological detecteion of nNOS

　　Key words nNOS Specific antibody Recombinant expression Skeletal muscle

　　一氧化氮合酶(NOS)有3种同工酶，即诱生型(iNOS)、内皮细胞型(eNOS)和脑型(nNOS)，它们均以L-精氨酸(L-Arg)为底物，在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等辅助因子的作用下生成L-胍氨酸和一氧化氮(NO)^［1，2］。nNOS主要分布于小脑、骨骼肌、外周氮能神经、交感神经、肾上腺、脊髓的某些区域等部位。nNOS的表达异常与某些疾病密切相关，如神经、肌肉疾病等^［3，4］。在nNOS的研究中，特异性抗体是非常重要的研究工具，由于nNOS与其他NOS之间存在有较高的同源性，且分子量较大(160 kD)，这就给nNOS抗体的制备带来较大困难。目前国外采用多肽合成的方法成功地制备了nNOS特异性抗体。我们通过基因工程的方法表达了nNOS特异性区域，并制备出了高效价的特异性抗体。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　质粒和菌种　pCMV/nNOS质粒，内含大鼠nNOS全长cDNA，由美国德克萨斯大学西南医学中心提供，pET/28a(+)表达载体购自Novegen公司，pGEM/3z质粒购于Promega公司。BL21及JM109宿主菌由本实验室保存。

　　1.1.2　酶和蛋白质及常用试剂　各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶等分别购自Boehriger公司、Promega公司、华美生物工程公司。Lambda/Hindlll,pBR322/Hinfl DNA分子量标准购自Gibco-BRL公司，HisTag ^TM　-Sepharose购自Novegen公司，nNOS抗体(p9203多肽合成法制备的抗体)由美国西南医学中心提供，常用化学剂主要为国产分析纯试剂。

　　1.2　方法

　　1.2.1　PCR扩增及基因重组技术　参考文献［5］。

　　1.2.2　重组蛋白的纯化　按Novegen公司的产品说明书进行，经HisTag ^TM　-Sepharose纯化的蛋白再用电泳回收法纯化，参考文献［6］。

　　1.2.3　抗体的制备　将2～4 mg纯化蛋白与完全弗氏佐剂混匀，充分乳化，接种至新西兰大耳兔足蹼，2 w后加强免疫1次，1 w后追加免疫1次。

　　1.2.4　Western blot分析　参见文献［4］。在检测肌肉样本中的nNOS蛋白时，将新鲜肌肉置于缓冲液A(10 mmol/L TrisCl,1 mmol/L EDTA/EGTA,0.5 mmol/L PMSF)中匀浆，取匀浆液作常规电泳。Duchenne肌营养不良症(DMD)的肌肉标本由南京市儿童医院神经内科提供，正常肌肉由江苏省肿瘤医院提供，mdx小鼠肌肉样品(已处理)由美国西南医学中心提供。

　　2　结果

　　2.1　nNOS(708～881 aa)蛋白片段编码基因的克隆及重组表达质粒的构建　用特异性引物1∶5 ′GG-GATCCATATGTCCTTTGAGTACCTAT-3′和引物2∶5′-CGGAATTCTAT CAGAACCTCACTAAGG-3′，以pCMV/nNOS质粒为模板，扩增后得到0.6 kb的特异性片段，将扩增片段用EcoR I和Nde I双酶切，电泳回收后与相同酶酶切的pET28a表达质粒DNA进行连接反应，经筛选得到重组质粒，命名为pET/nNOS 180，其质粒图谱如图1，用不同限制性内切酶进行酶切图谱鉴定，结果证实：插入片段中含有一个Bgl II位点和两个Nco I位点，与已报道序列完全相符，如图2。

图1　pET/nNOS 180重组质粒图谱

　　Fig.1 Plasmic map of pET/nNOS 180

　　图2　pET/nNOS 180重组质粒的酶切图谱

　　Fig.2 Restriction map of pET/nNOS 180 recombinant plasmid

　　Note:lane M:lambda DNA/Hind III marker;lane A: pET/nNOS 180(Bgl Ⅱ);lane B:pET/nNOS 180(Nco I);lane C:pET/nNOS 180(EcoR I/Nde I)；lane D:pET/28a (EcoR I/Nde I)

　　2.2　nNOS蛋白片段的表达和纯化　将重组质粒导入BL21宿主菌后，即得到重组工程菌，经IPTG诱导后，可见明显的额外表达带，如图3，重组蛋白约占菌体蛋白的10%～15%，经SDS-PAGE电泳初测分子量为22.000 kD，纯蛋白用质量飞行质谱测得分子量为22.364 kD，与理论计算值(22.117 kD，不考虑蛋白修饰)基本相符。pET28a载体中含有6个连续组氨基酸序列，这样，重组蛋白即可通过金属离子螯合的方法进行快速纯化。我们用Ni离子螯合的方法一次纯化重组蛋白的纯度可达90%以上，如图4。为得到更纯的蛋白作免疫抗原，我们又用电泳回收的方法得到纯度为100%的纯化蛋白(图谱略)^［6］。

　　2.3　nNOS特异性抗体的制备及活性鉴定　通过3次免疫后获得抗血清，用常规间接ELISA法测得在抗体稀释度分别为：1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000时，OD492nm与空白对照的比值(P/N)分别为9.5、8.5、8.1、5.4、2.6和1.6，抗血清的工作浓度初步可定于1∶8 000范围内。

　　为了观察nNOS抗血清与iNOS和eNOS的交叉反应，我们分别用3种NOS的标准品进行SDS-PAGE电泳、转移和Western blot分析，结果证实抗血清对iNOS和eNOS无任何交叉反应，如图5。业已证实，正常横纹肌中含有大量的nNOS蛋白，而DMD中含量明显减少^{［3，4，7］}，我们分别用自制抗体(下称抗血清)和多肽法制备的抗体(P9203)对肌肉标本中的nNOS进行了Western blot分析。结果表明：抗血清的工作浓度为1∶6 000时仍可检测到小鼠肌肉中的nNOS蛋白，其阳性条带与P9203的阳性条带相似(图未列出)。用1∶6 000的抗血清以相同的Western blot方法证实正常人肌肉中的nNOS含量明显高于DMD肌肉中的含量，与文献报道完全一致，如图6。

　　图3　nNOS 180重组蛋白在大肠杆菌中表达

　　Fig.3 Expression of nNOS 180 in E.coli

　　Note:lane A:induced for 0 h;lane B:induced for 1 h;lane C:induced for 2 h;lane D:induced for 3 h;lane E:induced for 4 h;lane M:protein molecular weight marker

　　图4　经HisTag-Sepharose纯化nNOS重组蛋白的电泳图谱

　　Fig.4 Electropheresis for nNOS recombinant protein purified by HisTag-Sepharose

　　Note:lane A and B:purified protein;lane M:protein molecular weight marker

图5　nNOS抗血清与iNOS和eNOS的交叉反应测定

　　Fig.5 Cross reaction detection for anti-nNOS antiserum with iNOS and eNOS

　　Note:lane n:nNOS standard protein;lane i:iNOS standard protein;lane e:eNOS standard protein

　　图6　nNOS蛋白在DMD肌肉和正常骨骼肌中的表达

　　Fig.6 Expression of nNOS protein in DMD and normal muscles

　　Note:lane M:prestained protein molecular weight marker;lane 1:normal muscles;lane 2 and 3:mdx mouse muscles;lane 4 and 5:DMD muscles

　　3　讨论

　　我们通过PCR的方法克隆了nNOS 708～881 aa片段的编码基因并将之插入pET28a原核表达质粒，成功地在大肠杆菌中进行了高效表达。我们首次以nNOS 708～881片段蛋白为抗原，免疫动物后得到高效价和高特异性抗体，采用上述抗体，成功地检测了正常横纹肌和DMD肌肉中nNOS的表达情况。

　　nNOS的N端与其它类型NOS的N端相比，有一段额外序列，就序列特异性讲，该段蛋白可作为免疫抗原并得到特异性抗体，但nNOS的N端含有GLGF序列能与庞大的GLGF相关蛋白(GAP)呈紧密结合^［8，9］，抗原决定簇易被掩盖，影响检测效果。目前国外采用多肽合成的方法，人工合成C端18个氨基酸，以此为抗原制备出特异性抗体。但由于合成肽较小，制备的抗体效价较低(最高为1∶5 000)且所含抗原决定簇少，可能会影响检测的灵敏度。本文实验证实，选择nNOS蛋白的中间区域作为免疫抗原即可克服上述缺点，另外，由于nNOS 708～881 aa位于钙调蛋白(CaM)结合区和FAD结合区之间，是电子传递的重要途径，我们所制备的抗体还可与之结合后并中和nNOS的酶活性(资料未列出)。

　　朱东亚　中国药科大学新药研究中心，南京210005

　　智　刚　Kim S Lau　James T Stull　UT Southwestern Medical Center at Dallas,TX USA

　　作者简介：陈　强，男，24岁，硕士生，主要从事生化药理学研究；

　　指导教师，朱敏生，男，34岁，博士生，副研究员，主要从事分子生物学和分子免疫学研究

　　4　参考文献

　　1　Nathan C.Nitric oxide as a secreatory product of mammaliam cells.FASEB J,1992;6:305

　　2 Nathan C,Xie Q W.Nitric oxide synthase:roles,tolls and control.Cell,1994;78:915

　　3 Brenman J E,Chao D S,Xia H et al.Nitric oxide synthase complexed with dystrophin in and absent from skeletal muscle sarcolemma in Duchenne muscular dystrophy.Cell,1995;82:743

　　4 Chang W J,lannaccones T,Lau K S et al.Neuronal nitric oxide synthase and dystrophin-deficient muscular dystrophy. PNAS USA,1996;93(17):9142

　　5 Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T M.Molecular cloning a laboratory manual.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989：p14.2-14.21

　　6 Hager D A,Burgess R R.Elution of protein from sodium dodecyl sulfate-polycrylamide gels,removel of sodium dodecyl sulfate and renaturation of enzymatic activity:results with sigma subunit of escherichia coli RNA polymerase,wheatgerm DNA topoisomerase and other enzymes.Anal Biochem,1980;109:76

　　7 Bredt D S.Targeting nitric oxide to its target.PSEBM,1996;211:41

　　8 Koenig M,Monaco A P,Kunkel L M.The complete sequence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein.Cell,1988;53(2):219

　　9 Ibraghimov-Beskrovnaya O,Ervasti J M,Leveille C J et al.Primary structure of dystrophin-associated glycoproteins liking dystrophin to the extra cellular matrix.Nature,1992;355(6362):696

〔收稿1997-10-27　修回1998-03-12〕