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HLA-A位点PCR-SSP基因分型和血清学分型的比较
中国免疫学杂志 1999年第2期第15卷 遗传免疫学
作者：嵇月华 冯 哲 杨 颖 冯明亮 陆 琼 倪建华 张雁征 陈仁彪
单位：上海输血研究所上海血液中心，上海200051
关键词：HLA-A；PCR-SSP；基因分型
中国图书分类号 R371.33
摘 要 目的：建立优化HLA-A位点PCR-SSP分型方法。方法：采用普通扩增仪和Eppendorf管对细胞系DNA和37个健康正常人进行基因分型，血清学检测采用标准淋巴细胞毒试验方法。结果：发现引物浓度和浓度比、DNA的纯度及酶的选用，是影响HLA-A位点PCR-SSP分型准确性的重要因素。该方法对37个标本的基因分型结果与血清学结果相符合。结论：PCR-SSP方法具有简便准确的优点，可以作为HLA-A位点分型的一种新途径并推广应用。
A comparison between PCR-SSP genotyping and serotyping for HLA-A locus
JI Yue-Hua，FENG Zhe,YANG Ying et al.
Shanghai Institute of Blood Transfusion,Shanghai Blood Center,Shanghai 200051
Abstract Objective:To establish experimental method of PCR-SSP for HLA-A locus genotyping.Methods:Genomic DNA from 37 non-related healthy individuals were tested by using ordinary PCR amplifier and Eppendorf tubes.Serological typing was conducted using standard microcytotoxicity method.Results:It was found that the concentrations and ratios of primers,the purity of DNA sample and the Taq polymerase employed seemed to be crucial for the accuracy of the HLA-A locus PCR-SSP.The genotyping results obtained with this method for 37 Hans coincide exactly with the serological results.Conclusion:The PCR-SSP method for the HLA-A locus is apparently a good alternative to the serological typing and could be spread for HLA-A typing.
Key words HLA-A PCR-SSP Genotyping
HLA-I类位点分型通常以血清学方法为主。基于DNA的分子生物学分型方法的应用，包括SSOP（Sequence Specific Oligonucleotide Probing)、PCR-SSP(Sequence Specific Primer)等，揭示了更丰富的等位基因及等位基因亚型多态性，同时弥补了移植工作中血清学方法的不足。第12届国际组织相容性会议(12th-IHWC)设立专题讨论HLA-I类位点的PCR-SSP分型技术并提供分型试剂盒。在使用普通扩增仪及500 μl Eppendorf 离心管的情况下，我们经过反复实验证实该试剂盒提供的操作规程及引物混合物不能进行正确分型。为此，本文以我国常见的等位基因A2、A9、A11、A26为例作PCR-SSP分型方法研究，并比较了37名汉族人中这些等位基因的分布情况。
1 材料与方法
1.1 质控DNA 采用12th-IHWC指定的全套标准DNA。
1.2 群体来源 抽取37名上海市汉族献血员的10 ml 外周血，其中5 ml血肝素抗凝用于HLA-AB分型，另外5 ml血1％EDTA抗凝用于DNA抽提。
1.3 HLA-AB分型 采用NIH补体依赖微量淋巴细胞毒方法，使用本室HLA-AB分型板［1］。
1.4 DNA抽提 分别采用粗提法、酚-氯仿法、快速盐析法抽提DNA［2，3］。
1.5 引物合成 引物序列来自12th-IHWC Class I ARMS PCR-SSP分型试剂盒使用说明书［4］，委托上海植物生理研究所合成引物。
1.6 PCR扩增 使用0.5 ml Eppendorf 离心管, 总体积13 μl，其中DNA为0.1 μg/管，dNTP(Promega公司)200 μmol/L，10×buffer (P.E公司) 1.3 μl，Mg2+ 2 mmol/L，Taq酶(P.E公司) 0.5 U/管，使用MJ-Research PTC-100扩增仪, 扩增参数如下：①95℃，2 min;②5个循环: 95℃，1 min;70℃，1 min;72℃，1 min；③20个循环: 95℃，1 min;65℃，1 min;72℃，1 min；④4个循环: 95℃，1 min;55℃，1 min;72℃，1 min；72℃，10 min。
1.7 电泳观察结果 吸取全部扩增产物于2%琼脂糖凝胶，电泳后观察结果。
2 结果
2.1 在特异性引物为1.0 μmol/L，内对照引物为0.2 μmol/L的情况下，图1显示质控DNA PCR-SSP基因分型结果，扩增片段长度见表1，结果无假阳性与假阴性出现。
2.2 经血清学定型的样本分别用粗提法、酚-氯仿法、快速盐析法抽提DNA后作扩增比较，酚-氯仿法抽提的DNA PCR-SSP分型结果与血清学分型结果吻合，快速盐析法和粗提法抽提的DNA分型结果不理想。
2.3 PCR-SSP对37名汉族人的分型结果见表2。
图1 1组6个引物混合物对确定特异性的质控DNA的分型结果
Fig.1 Control DNA specificity confirmed by the group of six primer mixes
Note:A. Control DNA: JAP-NF(A2,26) No.9227；B.Control DNA:PAR (A11,24) No.9226；C.Control DNA: WT51 (A23,/) No.9029
表1 HLA-A位点引物混合物、片段长度和特异性
Tab.1 HLA-A locus primer mixes, size of specificity product and specificity
| Primer No. | Size | Specificity |
| 03A | 813 bp | A2 |
| 05A | 555 bp | A23 |
| 06A | 555 bp | A24 |
| 08A | 400 bp | A26/4301 |
| 09A | 438 bp | A25/26/34/66 not A4301 |
| 12A | 518 bp | A11 |
表2 37名汉族人的血清学和PCR-SSP分型结果
Tab.2 The comparison of the results of 37 unrelated Hans by serology and PCR-SSP methods
| Alleles | Serotyping | Alleles | PCR-SSP |
| A2 | 16 | A2 | 16 |
| A9 | 11 | A23 | 0 |
| A24 | 11 | ||
| A10 | 2 | A26 | 2 |
| A26 | 18 | A11 | 18 |
3 讨论
PCR-SSP方法为HLA-I类抗原基因分型提供了新的途径。12th-IHWC提供HLA-I类位点的PCR-SSP试剂盒需要使用指定的9600扩增仪及簿壁管，若使用普通扩增仪则分型效果欠佳，因此本文在保留该试剂盒的引物序列及扩增程序的基础上，使用普通的MJ Research PTC 100扩增仪及500 μl离心管，以中国人常见的A2、A9、A10、A11为例重新建立了HLA-A位点PCR-SSP分型方法。其主要特点是：①增加特异性引物浓度至1.0 μmol/L，降低内对照引物浓度至0.2 μmol/L。适当提高特异性引物浓度能显著提高特异扩增效率及灵敏度，特异性引物浓度过高可能引起假阳性。②使用酚-氯仿法抽提的高纯度DNA。高纯度的DNA在一个较宽的浓度范围内都能清晰分型。纯度低的DNA易出现假阴性。③选用耐热性、活性、扩增忠实性好的P.E公司Taq酶。④扩增程序的各步骤的时间延长至1 min。使扩增程序在普通扩增仪及500 μl eppendorf离心管能得到有效执行。
实验证实，PCR-SSP方法能对A2、A11、A23、A24、A26等等位基因准确分型。PCR-SSP方法对37名汉族人的分型结果与血清学结果全部相符，而且血清学分型的11名A9者全部为A24，证实了11届国际组织相容性会议报道的中国南北方汉族人中A23频率分别为0、0.7％的数据［5］。显然根据12届国际组织相容性会议资料合成的引物能用于汉族人PCR-SSP分型，其分辨率略高于血清学分型。这表明，PCR-SSP方法分型在HLA-A位点可作为血清学方法的替换应用于科研和临床工作。HLA-A位点PCR-SSP基因分型和血清学分型的比较 上海市卫生局青年科研基金，编号：131954Y4
陈仁彪 上海第二医科大学生物学教研室和医学免疫学教研室，上海200025
作者简介：嵇月华，女，40岁，技师，主要从事免疫遗传学实验研究
4 参考文献
1 赵桐茂. HLA分型方法学. 见:赵桐茂主编.HLA分型原理及应用.上海:上海科学技术出版社, 1984:15-16
2 Charron D. Twelfth International Histocompatibility Workshop technical handbook. Paris:12th IHWC Secretariat,1996:4-6
3 Charron D. Twelfth International Histocompatibility Workshop technical handbook.Paris:12th IHWC Secretariat,1996:9-10
4 Bodmer J. HLA Class I SSP ARMS-PCR typing kit reference manual.London:Tissue Antigen Laboratory， 1995：26-27
5 Dyer P. Histompatibility Testing. NewYork：Oxford University Press，1993：260-267
〔收稿1997-10-22 修回1998-03-16〕