NK细胞研究的几个热点问题

NK细胞研究的几个热点问题

中国免疫学杂志 1999年第3期第15卷 述评

作者：田志刚

单位：山东省医学科学院基础医学所山东肿瘤生物治疗研究中心，济南250062

田志刚，男，42岁，研究员，博士，博士生导师，山东省医学科学院基础医学研究所所长，山东肿瘤生物治疗中心主任，中国免疫学会理事，《中国免疫学杂志》编委，主要从事免疫学及分子生物学研究。

　　1　NK细胞研究的沿革

　　70年代初NCI的研究人员在研究T细胞对靶细胞的特异杀伤时发现正常对照小鼠的脾细胞可以象免疫小鼠的脾细胞一样杀伤某些肿瘤细胞，继而发现正常人外周血淋巴细胞也可以天然杀伤某些癌细胞。这些细胞的杀伤功能不需要预先免疫或致敏，故取名为天然杀伤细胞(NK Cells)。NK细胞的发现引起了世界轰动，学者们进而提出了机体的Innate Immunity的主要承担者为NK细胞，并发现了NK细胞不仅对癌细胞，对病毒，胞内寄生菌和老化变异细胞都具有极强的清除能力。

　　70年代和80年代初期是免疫识别的收获季节。这期间Ig重排的起源和T细胞受体的多样性均逐渐显露端倪，使人类基本认清了机体主要免疫细胞清除无数抗原的奥秘所在。NK细胞发现以来的20年中免疫学家从未放弃研究NK细胞的识别机制，试图揭开NK细胞广谱识别“自我”与“非我”的机制，希望能象描述TCR或BCR一样描述NKCR。T细胞和B细胞主要司职“Acquired Immunity”，但这些功能以Innate Immunity为基础，NK细胞的功能和机制的彻底阐明不仅对揭开Innate Immunity之谜至关重要，也会对“Acquired Immunity”有全新的补充，从而得以从更高层次上解读免疫系统。

　　伴随着80年代中期细胞因子基因工程产品的问世和CD抗原家族及相应单抗商品化，细胞免疫治疗的基础与临床研究掀起新高潮，其中LAK细胞，ATL细胞，CIK细胞，CD3-AK细胞等各种经生物因子活化并扩增的效应细胞走上学术舞台。NK细胞的研究者们不但从中获得了更多的技术上的储备(NK细胞纯化，扩增，鉴定)，而且对这些广谱的杀伤细胞的功能有了新的见解。认为这些效应细胞是以NK为主体的“杀伤现象”，并非为一类新的细胞群。这些广泛的研究为NK细胞的深入探索积蓄了大量的资料。

　　自80年代中后期以来，NK细胞的研究开始蓬勃发展，尤其从90年代开始几乎令所有免疫学家应接不暇。学者们已经开始从NK细胞的形态特征，起源，识别杀伤机制，调节功能等诸方面全线出击，其中伴随着NK细胞的起源和识别两个主题的进展，NK细胞的传统观念发生了质的变化。

　　2　NK细胞研究的几个热点问题

　　2.1　NK细胞的发育生物学

　　2.1.1　NK和T、B细胞的共同前体细胞的发现　1994年Geogopoulos等发现，小鼠编码锌指纹蛋白(IKAROS)的基因发生突变或Knockout后，HSC向淋巴类细胞的分化被终止，其它造血细胞的分化不受影响，推测IKAROS基因的表达涉及HSC向淋巴类细胞的分化，即同时决定了NK、T和B细胞的发育。尽管SCID鼠无T和B细胞，但NK正常，SCID鼠在适当环境可以生存。IKAROS缺陷鼠则由于T、T和NK的缺陷而在出生早期死于各类感染，提示了NK作为机体免疫系统第一道防线的重要意义。

　　2.1.2　NK细胞与T细胞分化发育的关系　大量资料表明人类NK和T细胞在早期发育中可能存在共同前体细胞，与B细胞相比，NK细胞与T细胞在个体发生上更为接近。首先发现人类胚胎未成熟NK可表达CD3的所有4条链的基因，成熟NK受IL-2激活后仍可再表达CD3分子，提示NK细胞在个体发生更接近T细胞。未成熟NK表达CD3的能力强于成熟NK，提示NK早期发育中更接近于T。由于NK细胞所承担的细胞毒效应与CD8⁺的CTL有相近之处，且均与MHC有关，以及NK细胞分泌细胞因子的种类及数量又与CD4⁺Th细胞相近，故学者们倾向认为NK细胞和T细胞为个体发育上关系十分接近的两类细胞。

　　2.1.3　胚胎肝脏或胸腺存在NK与T细胞的共同前体细胞　胚胎肝脏是造血前体细胞的发源地，其中应包含淋巴类细胞的共同祖细胞。首先发现胎肝细胞悬液在PHA+IL-2存在下可分化为CD3⁺/TCR⁺的T细胞；但如果在同种异体受照细胞系H9+IL-2存在时则分化为CD3^-CD16⁺CD56⁺的成熟NK细胞，还发现胚胎肝脏中可分别分化为T细胞或NK细胞的共同前体细胞的特有标志为白细胞共同抗原(CD45)。Rodewald等观察到胚胎期CD16⁺CD4^-CD8^-的细胞如进入胸腺则发育分化为T细胞。如果脱离胸腺后移入合适的其它体内环境或体外环境则可分化为NK细胞。诱导NK或T细胞的体外环境与胚肝细胞分化为NK和T细胞的条件相一致，此时CD16抗原成为胚胎胸腺中NK/T细胞共同前体细胞的特有标志。继而Minger等发现新生儿胸腺中CD7⁺CD3^-CD8^-CD4^-细胞可在PHA+IL-2作用下分化为成熟的T细胞(CD3⁺/TCR⁺)，或者在H9+IL-2作用下分化为成熟NK细胞(CD3^-CD16⁺CD56⁺)。如果CD56^-分化为T细胞，而CD56⁺将分化为NK细胞。

　　2.1.4　骨髓为NK细胞分化发育的场所　骨髓CD34⁺CD7⁺DR⁺的前体细胞经长期培养后可分化为NK细胞，其CD34抗原在分化为NK细胞时，CD34抗原消失，代之而来则为CD2、CD16和CD56的标志。HSC分化为NK细胞时必须有IL-2存在，但与IL-7和干细胞因子(SCF)共存时，NK细胞的发育分化与扩增将大幅度增加。由于IL-2缺陷小鼠中NK仍可正常发育，以及骨髓基质细胞并无IL-2分泌，人们开始寻找NK分化所必需的调节因子。近期人们发现骨髓基质细胞可表达IL-15mRNA，长期培养的骨髓基质细胞上清中含IL-15。CD34⁺的HSC细胞体外培养中单独IL-15则可以促发其向NK细胞分化。

　　2.2　NKCR及其识别功能

　　2.2.1　NK细胞识别靶细胞的几种可能模式　NK细胞与T细胞和B细胞不同，它区分自我与非我的方式可能至少有3种方式：①针对通称为NK敏感靶细胞(如K562细胞)的杀伤效应，该杀伤功能不受靶细胞是否表达MHC的影响；②NK细胞受IL-2激活后可展现更为宽广的杀瘤谱，可杀伤大部分肿瘤细胞及某些正常细胞；③近期阐明的称为“丢失的自我(Missingself)”的识别方式，主要识别缺乏MHC I类抗原或突变的MHC I类抗原的靶细胞，从而弥补了CTL细胞必须识别的MHC I类抗原阳性的靶细胞而无法杀伤MHC I类阴性的细胞缺陷。

　　2.2.2　NK杀伤功能与靶细胞MHC-I类分子　已经证明某些低水平表达MHC-I类分子的淋巴类细胞较易为NK所识别而杀伤。采用基因转染技术将NK敏感的靶细胞经转基因处理为高表达MHC-I类基因，可使该靶细胞变为NK抗性细胞。Storkus等将HLA-A3或HLA-B7基因转入HLA阴性、EB病毒转化的B淋巴母细胞系，可使该细胞由NK敏感型转化为NK抗性细胞。采用遗传杂交分析技术可将该功能的遗传定位为HLA的α1/α2区域。进一步发现HLA分子的某一个特定氨基酸的替代(如HLA-A2的His或HLA-A3的Asp)与这种保护效应有关，即靶细胞表面的HLA分子细微变化可足以导致靶细胞本身对NK杀伤的敏感性的变化。通过分子突变技术进一步发现HLA分子的微小变化主要发生在第74位残基上，该部件正是HLA与多肽抗原形成复合物的空间结构的核心部位。

　　2.2.3　人类NK受体(NKR)的发现　①P58分子的发现，Moretta等首先建立了一系列NK细胞克隆系，发现可溶性抗P58单抗可阻断HLA-C类分子与P58的结合，使HLA-C类分子与NKR(P58)之间传递的“阴性信号”被阻断，导致了NK对靶细胞的杀伤，P58cDNA已被克隆，发现与存在于小鼠的类似分子Ly49分子或C类凝集素基因家族无同源性；②Kp43(CD94)和NKB1(P70)与识别HLA-C类分子受体P58一样，NK细胞亦存在识别HLA-B类分子的受体。已发现有针对HLA-B7/BW6的KP43(CD94)和针对HLA-B58/BW4的NKB1(P70)。CD94和NKB1为结构及分子量均不同的两个分子，与P58亦无相同之处。引人注目的是CD94可表达于所有NK表面，P58仅在部分NK表达。高表达CD94(CD94 bright)的NK细胞与HLA-B7(BW6)之间可传递“阴性信号”。

　　2.2.4　小鼠NK受体(NKR)的发现——Ly49家族　Ly49分子是类似于人类存在的P58分子或者NKB1分子，其研究的广度与深度均强于人类NKR的研究。根据所发现的时间顺序，Ly49分子家族已发现了Ly49A、Ly49B、Ly49C、Ly49D、Ly49E、Ly49F和Ly49G等分子。Ly49A最初发现于小鼠胸腺瘤细胞(EL4)，分子量44 kD的二聚体，cDNA克隆研究表明其基因相连于NK1.1抗原的基因区。Ly49A极少表达于T细胞，在IL-2作用后可持续表达于CD3-NK1.1+脾细胞。Ly49A与NK1.1(又称NKR-P1)的结构相似，二基因相连以及共表达于NK细胞等特性，提示Ly49A对NK细胞的功能有重要作用。将NK细胞分为Ly49A⁺和Ly49A^-两大群体，发现这两大群体细胞除存在NK共有功能(YAC-1杀伤、ADCC、凝集素强化杀伤和抗体再定位杀伤等)和标志(CD3^-CD4^-CD8^-Sig-NK1.1⁺)外，二者对一系列小鼠靶细胞的杀伤存在差异。这种差异与靶细胞的MHC的单倍型有关，不同之处在于NKR与MHC-I类分子α1/α2区结合，而CD8⁺TCR与MHC-I类分子的α3区结合。

　　2.2.5　介导NK细胞活化的受体　NK细胞表面的IgG类FC受体(FcrRIII,亦称CD16)可通过ADCC效应启动NK的杀伤功能。NK亦可为CD2或CD69所活化而呈现杀伤效应。但是CD2、CD16和CD69均不是启动NK杀伤所必需，NK细胞的杀伤功能多数情况下是自发启动的。现已发现一类重要的NKR分子，其具备了Ly49家族的类似功能与特性，称为NKR-P1(亦称NK1.1)。NKR-P1为30 kD的二聚体组成，与Ly49分子家族无同源性，但二者均为C类凝集素超家族中一员，二者基因亦均位于6号染色体上NK基因复合体(NKC)内。抗NKP-P1单抗启动NK杀伤的过程称为“再导向杀伤(Redireted lysis)”。据此学者们认为NKR-P1为一介导NK活化的特异受体。人类KP43可能为活化NKR，为43 kD的二聚体，在介导NK杀伤中起活化作用。另外还发现称为NKG2的分子家族，至少已发现了5个多态性分子，互相间有极大同源性，其功能特性尚在探索之中。

　　3　NK细胞的免疫学调节功能

　　3.1　NK细胞是机体天然免疫的主要承担者　T细胞对特定抗原的反应仅是T细胞库中极少比例的T细胞的反应，需要相当长的过程方可达到峰值(10天以上)。NK细胞不需特异抗原的刺激，反应十分迅速，可在数小时或一天内达到高峰。NK细胞被触发的第一个反应是迅速分泌大量的细胞因子(IFNγ，TNFα，GM-CSF，IL-3，M-CSF等)，其中IFNγ在体内的免疫反应至关重要。NK细胞所产生的细胞因子的主要意义在于调节吞噬细胞的功能。采用T细胞和B细胞均缺陷的SCID鼠为实验模型，发现该鼠含有正常的NK和MΦ功能。采用抗IFNγ单抗或抗NK抗体以阻断SCID鼠体内IFN的功能或直接去除NK细胞，该鼠均出现MΦ的数量及功能的大幅度下降，同时变为极易被肿瘤、细菌或病毒所攻击致死。NK细胞体内产生IFNγ的能力主要受IL-12的调节，体内IL-12的来源主要由吞噬细胞(单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、郎格罕细胞等)所提供，从而形成了一个互相调节的天然免疫防线。

　　3.2　NK细胞是获得性细胞免疫的核心调节细胞　正常BALB/c鼠为利氏曼菌易感鼠，可导致100%死亡。IL-12在感染早期注入后，不但可大幅度减少死亡率，还可使小鼠产生针对再次攻击的免疫力。如果将该小鼠NK去除，IL-12治疗不可能产生上述治疗效果，亦不出现Th1类细胞因子占主导的细胞免疫反应。正常CH3鼠为利氏曼菌不敏感鼠，体内呈现Th1类细胞因子状态。当去除NK细胞后，体内呈现Th2类细胞因子状态，同时开始变为利氏曼菌敏感而致死。上述试验直接证明IL-12对机体Th1类细胞因子的主导作用完全依赖于NK细胞的存在，其中NK细胞产生IFNγ至关重要。

　　SCID鼠和裸鼠体内均无T细胞反应。当病毒感染时NK细胞大幅度提高且可持续远比正常BALB/c鼠长的NK高峰反应期(可达14天)，正常鼠仅持续3天左右。NK细胞活性在正常鼠体内受CTL调控，其CD8⁺CTL细胞可通过产生IL-4和TGFβ(又称为CD8 Th2类细胞因子)抑制NK活性。NK和CTL均可受IL-2的正向调节，二者受IL-2调节的状况有极大区别;NK细胞可持续表达低亲合力IL-2R，从而在任何时间可针对较高浓度IL-2而出现反应；CTL细胞仅在活化后表达低亲合力IL-2R，从而只有活化的有限的T细胞克隆可出现针对IL-2的反应，但IL-2仅需较低浓度即可触发反应。

　　近年发现NK缺陷病人承受着危及生命的多种病毒的感染。该病人体内CD3^-CD16⁺CD56⁺NK细胞缺乏，同时CD8⁺CD45RO⁺T细胞(记忆T细胞)和CD8⁺CD57⁺(效应T细胞)的数量大幅度下降。正常鼠NK被去除后，机体对多种病原体的侵袭和肿瘤的产生的抵抗力大幅度下降，尤其是再次免疫反应较难产生。这主要因为NK缺乏而导致CD8⁺的CTL的功能丧失有关。采用混合淋巴细胞试验(MLC)观察NK对CTL的调节作用。发现在反应体系中去除CD16⁺CD56⁺的NK细胞后，CTL细胞可针对同种异体抗原产生增殖反应而无法分化为成熟的具有杀伤功能的效应细胞。CTL前体细胞分化为成熟CTL必须直接与NK细胞接触，NK细胞分泌的可溶性分子无此效应。NK细胞与CTL接触的分子为CD56。采用抗NK单抗(NK1.1)去除小鼠体内NK后，该小鼠无法产生针对所荷黑色素瘤(B16)的特异性CD8⁺CTL细胞，而且对再次攻击无记忆反应。尤为引人注目的发现是，不仅原始T细胞(Naive T)(初步免疫反应的主体细胞)需要NK的辅助方可启动免疫反应，休止的记忆T细胞(2次免疫反应的主体细胞)也需要NK的辅助方可分化为效应细胞而最终行使免疫学功能。

　　3.3　NK细胞是造血的主要调控成分　鉴于是否存在NK功能亚群或者类似于Th1/Th2的分泌不同类细胞因子的亚群尚不明确，同时不同活化状态的NK细胞本质的资料亦不充足，导致NK对造血的调控作用仍众说纷纭。目前主要有三大方面的研究。①对自身造血的影响：主要有两大学派：“NK抑制造血说”和“NK促进造血说”。这两派学说所采用的NK的活化状态不同(例如IL-2刺激与否)、NK的亚群鉴定方法不同和NK可分泌的细胞因子种类不同(TNFα，IFNγ，TGF-β抑制造血；IL-3，IL-6，GM-CSF，M-CSF，IL-7等促进造血)，从而得出了各自假说。这些假说的最终定论均有待于NK细胞最终本质的揭秘。②对异体骨髓的影响：NK细胞对于异体实体器官的排斥功能并不十分明显，但针对异体骨髓植入的排斥却远快于T细胞体系。纯系小鼠F1代的NK细胞甚至可针对母代的骨髓产生排斥反应，从而出现了不符合器官免疫排斥规律的“杂交抵抗(Hybrid resistance)现象”。③体外对造血干细胞的影响：为使NK细胞对造血的调控更为具体直观，同时已发现NK细胞的体内定位迁移与造血干细胞(CD34⁺)基本一致(一起发源于胎肝、骨髓等)，各国学者开始采用“纯化”的NK和CD34⁺干细胞进行体外培养以观察二者的直接相互作用。相信该领域的研究将为形成新的骨髓移植/过继细胞免疫治疗(BMT/ACI)联合治疗方案奠定基础。

　　4　参考文献(略)

〔收稿1999-01-18〕