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B16黑色素瘤与活化B淋巴细胞融合瘤细胞免疫原性的改变
中国免疫学杂志 1999年第3期第15卷 肿瘤免疫学
作者：陈习武 秦慧莲 何球藻
单位：上海医科大学免疫学教研室，上海200032
关键词：黑色素瘤；细胞融合；混合淋巴细胞肿瘤细胞培养
中国图书分类号 R392.3 R730.51
摘 要 目的：了解肿瘤细胞与活化B淋巴细胞的融合能否提高前者的免疫原性。方法：分别取亲本B16黑色素瘤和融合瘤细胞B16.B主动免疫同系小鼠，观察免疫小鼠脾脏淋巴细胞(SPL)对亲本瘤细胞体外再刺激的反应能力。结果：发现B16.B免疫小鼠SPL较B16免疫小鼠SPL有更明显的增生反应，同时前者还能分泌更高水平的细胞因子(IL-2、IFNγ和TNFα)。结论：与亲本肿瘤相比，融合瘤细胞的免疫原性有明显提高。
The enhancement of immunogenicity of B16 melanoma fused with activated B lymphocytes
CHEN Xi-Wu,QIN Hui-Lian,HE Qiu-Zao.Department of Immunology,Shanghai Medical University,Shanghai
200032Abstract Objective：To make sure if fusing with activated B lymphocytes could improve the immunogenicity of tumor cells.Methods：The syngenic mice were immunized with parental B16 tumor cells and B16.B fusing cells.Then,SPLs of immunized mice were co-cultured in vitro with parental B16 cells,the proliferation of SPLs and the secretion of certain cytokines were assayed.Results:SPLs from B16.B immunized mice showed more potent proliferation and could produce higher level IL-2,TNFα and IFNγ in response to B16 stimulation.Conclusion:The immunogenicity of fused cells is higher than parental tumor cells.
Key words B16 melanoma Cell fusing Mixed lymphocytes tumor cell cultur
疫苗主动免疫能够调动机体的免疫功能。由于肿瘤细胞免疫原性太弱，用于主动免疫时通常难以诱发出有效的免疫应答反应。通过肿瘤细胞与活化的B淋巴细胞融合途径来修饰肿瘤细胞的目的在于提高其免疫原性，以制备肿瘤疫苗［1］。我们用融合后的瘤细胞主动免疫小鼠，观察免疫宿主的脾细胞能否在体外对瘤细胞产生再次特异免疫应答。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒、细胞与动物 水泡性口炎病毒(VSV)，液氮冻存。B16黑色素瘤(H-2b)和L929(小鼠纤维瘤细胞)均由第二军医大学免疫学教研室曹雪涛教授惠赠，WEHI-164(小鼠纤维肉瘤)和EL4(小鼠胸腺瘤，H-2b)由美国华盛顿大学医学院肿瘤系Disis教授惠赠，本室保种传代。C57BL/6小鼠，清洁级，雌性，6～8 w,购自中英合资上海必凯实验动物公司。
1.1.2 主要试剂 RPMI1640培养基，购自Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)，购自华美公司；氯化锂(LiCl)，上海新海化工厂产品；放线菌素D(Actinomycin D),购自华美公司；3H-TdR 37 MBq/ml，上海原子能研究所产品；丝裂霉素C(MMC),日本协和制药株式会社产品；Alamar Blue,Biosource International公司产品，Disis教授惠赠。
1.2 方法
1.2.1 动物免疫和脾细胞制备［2］ 取B16(H4)细胞(经克隆筛选的H-2Kb，Db阴性的B16瘤株)、融合瘤细胞〔B16(H4)和活化B淋巴细胞的融合瘤细胞，在体外经过短期培养，荧光双标记检测显示B7阳性率为27.1%，H-2Kb阳性率为72.8%〕，以MMC灭活后分别腹腔免疫C57BL/6小鼠，1×106细胞/只，1次/w ，连续3 w，最后一次免疫后第4天处死小鼠，无菌制备SPL备用。
1.2.2 融合瘤细胞体内免疫诱导的淋巴细胞特异性增殖反应［3］ 取亲本B16(H4)作为刺激细胞，以100 μg/ml MMC 37℃水浴灭活45 min，以含5%小牛血清的Hank液洗涤细胞3次，调整细胞浓度为1×106ml-1，分别制备不同瘤细胞免疫组小鼠脾细胞(SPL)作为应答细胞，进行再次肿瘤细胞淋巴细胞混合培养(2° MLTC)，调整细胞浓度为5×106ml-1，淋巴细胞和肿瘤细胞均按100 μl/孔加入96孔圆底培养板，刺激细胞与应答细胞比例为1∶5，设B16、EL4及脾细胞对照，37℃，5%CO2培养120 h，终止培养前16 h加入3H-TdR 37 MBq/孔，培养结束后以多头细胞收集仪收集细胞，β-液闪计数仪测量cpm。
1.2.3 特异性淋转诱生的细胞因子的检测［4-6］ 按1.2.2设计2° MLTC实验，取MLTC的上清作为IL-2、IFNγ的检测样品。用IL-2依赖细胞株CTLL-2检测IL-2水平。IFNγ的检测采用VSV-L929系统，以样品诱导L929细胞对VSV攻击的保护作用表示样品中IFNγ效价。TNF检测方法简述如下：将MLTC上清按50 μl/孔加入96孔平底板，对照为不同免疫鼠的单独SPL培养上清，然后每孔加入5×104/50 μl的WEHI-164细胞，再加入氯化锂和放线菌素D(终浓度分别为40 mol/L和2 μg/ml)，常规培养18 h后，每孔加入10 μl Alamar Blue，继续培养18 h，培养结束后在570 nm波长处测OD值，以实验组与对照组OD值的差值标示样品中TNF的活性［6］。
2 结果
2.1 免疫小鼠SPL体外特异性增殖反应 体外混合淋巴细胞肿瘤细胞培养表明，融合瘤细胞B16.B免疫小鼠的SPLs对B16(H4)刺激有明显的增殖反应，而B16(H4)免疫动物的SPLs对B16(H4)刺激的反应水平较低，两者相比，P＜0.01，实验结果还表明融合瘤细胞免疫动物有非特异的免疫功能的提高，因为用同品系(H-2b)的EL4瘤细胞作为刺激细胞时，也可产生一定水平的增殖反应，但显著低于B16(H4)再刺激诱发的增殖反应，P＜0.05。融合瘤免疫组SPLs自发性增殖水平较高也提示该组小鼠SPL在体内已受到较好的预致敏(表1)。
表1 免疫小鼠脾细胞体外特异性增殖反应(n=5)
Tab.1 The specific proliferation response of SPL of immunized mice(n=5)
| Responder1) | Stimulator | ||
| B16(H4) | EL4 | PBS | |
| B16.B | 4 414.4±1 136.12) | 2 790.5±675.43) | 1 093.0±158.64) |
| B16(H4) | 1 551.5±906.85) | 824.2±279.4 | 397.2±178.7 |
| PBS | 397.2±178.7 | 305.7±71.0 | 348.7±106.3 |
note:date in this table is cpm.1) SPLs from mice immunized with different tumor cells;2)compared with 3)，P＜0.05；2)compared with 4) and 5),P＜0.012.2 体外诱生免疫小鼠脾细胞产生细胞因子 融合瘤免疫小鼠脾细胞与亲本瘤细胞共育的MLTC培养上清可检测到明显的IFNγ活性，表现为其上清与L929共育时，能诱导出L929对VSV的抵抗，在样品稀释度为1∶1和1∶4时，OD值为1.12±0.16和0.80±0.08，而亲本B16与PBS免疫组未能测到明显的IFNγ活性，其OD值明显低于前者，P＜0.05(图1)。CTLL-2细胞检测IL-2结果也提示两组间存在差异，表现为实验组上清能够更明显地促进CTLL-2细胞的增殖，OD值明显高于B16(H4)免疫组，P＜0.01(图2)。WEHI-164是TNF敏感的小鼠纤维肉瘤，MLTC上清中若存在TNF活性则将会导致该细胞的死亡，我们采用Alamar Blue来检测该细胞的增生以反应TNF活性。Alamar Blue是一种植物染料，通常呈蓝色，在细胞增殖时该染料被降解，由蓝色变为粉红色，在570 nm波长可测得OD值升高，反之，细胞死亡越多则此波长时OD值越低。结果表明B16.B免疫组SPL能分泌TNF，即实验组OD值明显低于对照组，P＜0.05(图3)。
图1 不同瘤细胞免疫组的SPLs MLTC上清中IFNγ活性的检测(n=5)
Fig.1 The detection of IFNγ by SPLs of immunized mice during MLTC(n=5)
图2 不同瘤细胞免疫组的SPLs免疫小鼠脾细胞MLTC上清中IL-2的检测(n=5)
Fig.2 The detection of IL-2 by SPLs of immunized mice during MLTC(n=5)
图3 不同瘤细胞免疫组的SPLs MLTC上清中TNF活性的检测(n=5)
Fig.3 The detection of TNF by SPLs of immunized mice in MLTC(n=5)
3 讨论
MLTC是常被用于检测细胞免疫原性的一种重要方法。当用不同的瘤细胞作为刺激细胞在体外诱发相同品系的淋巴细胞应答时，增殖水平常常可以代表瘤细胞抗原刺激的强弱，即可反映出瘤细胞的免疫原性。在以前的实验中，已经观察到融合后的瘤细胞获得了H-2b和B7分子的表达［7］，在体内可诱导较明显的抗肿瘤免疫应答反应，而亲本B16瘤细胞却无此能力［8］，提示融合瘤细胞的免疫原性的增高。
本文实验进一步采用融合瘤细胞和亲本B16瘤细胞免疫动物，观察它们能否诱导出特异的致敏淋巴细胞。由于融合瘤细胞表达H-2b和B7分子，具有较强的免疫原性［9，10］，因此，融合瘤细胞免疫鼠的SPL对B16的瘤细胞表现出较高水平的增生反应，明显超过用B16免疫鼠SPL的应答水平，而且这一反应表现出有一定的特异性，表现在融合瘤免疫鼠的SPL对B16的应答明显高于对H-2相同来源的EL4瘤细胞的应答。这种变化还反映在MLTC上清中检测到的细胞因子(IL-2、IFNγ和TNFα)的水平的不同。在体外再次MLTC反应系统中测到细胞因子的变化基本上与MLTC中增生反应的改变一致，这进一步说明经过融合的瘤细胞比亲本B16瘤细胞有较高的免疫原性。
上述体外实验结果表明，融合瘤细胞的免疫原性较亲本B16有显著提高，作为候选的肿瘤细胞疫苗有它的潜在价值。
B16黑色素瘤与活化B淋巴细胞融合瘤细胞免疫原性的改变 本文由国家教委博士点基金资助(No.94058)
作者简介：陈习武，男，32岁，博士，主要从事肿瘤免疫及趋化蛋白的研究；
秦慧莲，女，46岁，教授，主要从事肿瘤免疫的研究；
何球藻，男，63岁，博士，教授，博士生导师，主要从事肿瘤免疫和移植免疫的研究
4 参考文献
1 Guo Y,Wu M， Chen H et al. Tumor vaccine generated by fusion of hepatoma cells with activated B cells.Science,1994;263:518
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7 陈习武，秦慧莲，何球藻.黑色素瘤与活化B淋巴细胞融合瘤的建立及体内外生长特性.中国免疫学杂志，1997；13(3)：150
8 陈习武，秦慧莲，何球藻.B16黑色素瘤与活化B淋巴细胞融合瘤主动免疫诱导抗瘤作用的初步研究.中国免疫学杂志，1997；13(5)：277
9 Hui K,Grosveld F,Festenstein H.Rejection of transplantable AKR leukemia cells following MHC-DNA mediated cell transformation.Nature,1984;311:750
10 Chen L,Linsley P S,Hellstrom K E et al.Costimulation of T cells for tumor immunity.Immunol Today,1993;14:483
〔收稿1997-12-15 二次修回1998-07-01〕